• هزینه‌های ثابت بالا است، نرخ عرضه ثابت است اما تقاضا متغیر، فصلی و اغلب غیر قابل پیش‌بینی است؛

• صنعت گردشگری، صنعتی تولیدی و خدماتی است؛

• طیف وسیعی از گردشگران وجود دارند که به‌دنبال برآوردن نیازها و انتظارات گوناگون خود هستند؛

• خدمات به‌صورت مستقیم به مشتری ارائه می‌شوند و مشتری اغلب بدون هیچ محصول فیزیکی بنگاه را ترک می‌کند؛

• از مدیران انتظار می‌رود تا هم از مهار‌ت‌های حرفه‌ای و تخصصی برخوردار باشند و هم از مهارت‌های مدیریتی؛

• مهارت‌های متنوع بسیاری مورد نیاز است اما تعداد نسبتا زیاد کارکنان این صنعت را افراد نیمه ماهر یا فاقد مهارت تشکیل می‌دهند؛

• اغلب کارکنان دارای حقوق پایین هستند؛

• از کارکنان انتظار می‌رود ساعت‌های طولانی و در ساعت‌های غیرمعمول کار‌ کنند؛

• سهم بزرگی از نیروی کار را زنان، کارکنان پاره‌وقت، کارکنان غیر رسمی^[۱۷۴]، دانش‌آموزان و مهاجران تشکیل می‌دهند؛

• اغلب، اعضای واحدهای تجاری اندک است؛

• جابجایی نیروی کار بالا است و ورود و خروج افراد در سازمان‌ها زیاد است؛

• حجم عمده هزینه‌های صنعت ناشی از هزینه‌های نیروی کار است.

از میان ویژگی‌های ذکر شده برای واحدهای فعال در صنعت گردشگری، بزرگ‌ترین اثر بر بازارهای نیروی کار گردشگری، اثر تغییرات در تقاضای کوتاه مدت محصولات گردشگری است که اثر واضح و بزرگ بر تأمین نیروی کار یک بنگاه دارد. در کنار این موضوع، بالا بودن سهم هزینه‌های نیروی کار در میان کلیه هزینه‌های بنگاه است. بنابراین، بسیاری از کارفرمایان تلاش کرده‌اند تا هزینه‌های نیروی انسانی خود را حداقل کنند. این بدین معنا است که صنعت گردشگری و مهمان‌نوازی، یه طور سنتی تأمین نیروی خود را از کارکنان حاشیه‌ای^[۱۷۵] شامل زنان، افراد جوان، دانشجویان و دانش‌‌آموزان، مهاجران و اقلیت‌های قومی انجام دهد. در نتیجه، این نیروهای کار، مبنایی برای نیروی کار غیر رسمی و پاره وقت ایجاد می‌کنند. چنین نیروی کاری، خود را در شغلی با مهارت‌های پایین می‌یابد که ویژگی آن دستمزد پایین است و در نتیجه انگیزه و تعهد وی به کار کم می‌شود. با این همه باید توجه داشت که این موضوع به تمامی سازمان‌ها و افراد فعال در این صنعت عمومیت ندارد بلکه بخش عمده آن‌ها را پوشش می‌دهد (نیکسون، ۲۰۰۷).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۶-۵-۲- حوزه مدیریت و بعد زمانی
مدل کسب‌وکار می‌بایست در طول زمان مدیریت و توسعه داده شود. به عبارت دیگر چطور می‌توان منظر فرایند استراتژی را در مدل کسب‌وکار وارد کرد. مدل کسب‌وکار نه‌تنها در بعد بین بخشی (عرضی) می‌تواند مورد مطالعه قرار بگیرد (بعد علی و معلولی، خط قائم در طرح کلی مدل)، بلکه هم‌چنین رشد و تکامل مدیران و افراد در داخل سازمان و مشتریان و رقبا در خارج سازمان، در طول زمان نیز تکامل می‌یابد (بعد طولی، خط افقی در طرح کلی مدل). در دنیای واقعی، بخش‌های بازار و مشتریان تغییر می‌کنند، رقبا نیز تغییر می‌کنند، منابع و شایستگی‌های سازمان تغییر می‌کنند و عوامل تولید و ورودی‌های تولید تغییر می‌کنند. فرایندهای مدیریت مورد نیاز برای تغییر مولفه‌های مدل کسب‌وکار، شامل کاهش موانع شناختی، فرهنگی، سیاستی و مقوله‌هایی می‌باشند که مدیران به طورمرتب برای همه مولفه‌‌‌های مدل با آن‌ها مواجه هستند (هدمن و کالینگ، ۱۳۹۰).
نکات مدیریتی نیازمند توجه در یک بنگاه واسطه توزیع در گردشگری را می‌توان نیاز به یکپارچگی (ثبات) قیمت، توجه به ویژگی غیرقابل ذخیره بودن محصول گردشگری و فصلی بودن تقاضای گردشگری، نیاز به هماهنگی بالا میان بازیگران صنعت، دقت در انتخاب کارگزاران خارجی و توجه به حقوق مصرف‌کننده دانست (داسویل، ۱۹۹۸).
بعد زمانی در ارتباط با مدل کسب‌وکار گردشگری به تغییرات در سلایق بخش‌های مختلف بازار گردشگری اشاره دارد. در طول زمان، روش خاصی از مصرف، مد یا سبک زندگی از سوی طبقه اقتصادی- اجتماعی جامعه گسترش می‌یابد. یک نخبه، مدی را القا و رواج می‌دهد که بعداً توسط بخش‌های بیشتر جامعه که می‌توانند و تلاش می‌کنند تا از رفتار نخبگان تقلید کنند، رواج پیدا می‌کند. در ادامه، گروه‏های برجسته به سمت تجارب جدید و منحصر بفرد می‌روند و مقاصد جدیدی را جستجو می‏کنند (مافورث و مونت^[۱۷۶]، ۲۰۰۹).
از سوی دیگر، رشد گردشگری انبوه منجر به مشکلاتی از قبیل تنزل فرهنگی، اجتماعی و محیطی، توزیع نابرابر مزایای اقتصادی، گسترش نگرش‌های پدرمآبی و شیوع بیماری‌ها شده است. امروزه اشکال جدید زیادی از گردشگری (تحت عناوینی چون گردشگری پایدار، سبز، مسئول، کم‌اثر، جامعه محور و حامی فقرا) در حال بروز بوده و در تلاشند تا با اثرات منفی گردشگری انبوه دست به گریبان شوند و ادعا می‌کنند که جایگزین، متفاوت یا پایدارند (مافورث و مونت، ۲۰۰۹). بنگاه‌های گردشگری، با توجه به اصول توسعه پایدار، تفاوت اشکال جدید گردشگری با گردشگری را انبوه را می‌توان در جدول زیر خلاصه کرد.
جدول ۳. ویژگی های گردشگری انبوه در مقابل اشکال جدید گردشگری

گردشگری انبوه متعارف
اشکال جدید (جایگزین) گردشگری

ویژگی های عمومی

توسعه‌ی سریع
توسعه‌ی کند

بیشینه سازی
بهینه سازی

بی توجهی به مسائل اجتماعی/زیست محیطی
توجه به مسائل اجتماعی/زیست محیطی

لجام گسیخته
تحت کنترل

کوتاه مدت
بلند مدت

بخشی
کلی

کنترل خارجی
کنترل محلّی

۷-۲-۳- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام ۴۳

۸-۲-۳- بررسی حضور مقاومت های چند گانه ۴۳

۹-۲-۳- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی ۴۴

۱۰-۲-۳- انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز ۵۰

۱۱-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ و ۲ ۵۲

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۱۲-۲-۳- الکتروفورز روی ژل آگارز ۵۳

۱۳-۲-۳- شناسایی کاست ژنی اینتگرون ۵۴

۱۴-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاست‌های ژنی اینتگرون کلاس ۱ ۵۵

۱۵-۲-۳- تعیین ترادف محصولات ۵۶

۱۶-۲-۳- آزمون آماری ۵۶

فصل چهارم: نتایج

۱-۴ نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲ ۵۷

۲-۴ نتایج بررسی کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها ۶۳

۳-۴ نتایج تعیین توالی کاست‌ ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها ۶۵

عنوان صفحه

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری ۶۷

فهرست منابع ۷۵

پیوست ۸۹

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول۱-۱: طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر ۱۰

جدول ۱-۳: دستگاه­ها وسائل آزمایشگاهی مورد استفاده ۳۴

جدول ۲-۳: مواد شیمیایی مورد استفاده ۳۵

جدول ۳-۳: آنتی‌بیوتیک‌های استفاده شده برای آنتی‌بیوگرام ۳۹

جدول۴-۳: دیسک‌های آنتی‌بیوتیک استفاده شده، مقادیر ماده موثره آن‌ها

و تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی ۴۱

جدول ۵-۳: خصوصیات روش آزمایش آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن)

بر اساس معیارهای CLSI (NCCLS) 42

جدول ۶-۳: اطلاعات نمونه های کارشده ، گرفته شده از مزارع گوشتی

شهرستان شیراز ۴۵

جدول ۷-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ واینتگراز ۲ ۵۰

جدول ۸-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس۱ ۵۰

جدول۹-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژن های

اینتگراز ۱ و اینتگراز ۲ ۵۱

جدول۱۰-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کاست ژنی

اینتگرون کلاس ۱ ۵۱

جدول۱۱-۳: غلظت استوک مواد اولیه مورد استفاده در واکنش زنجیره­ای پلیمراز ۵۱

جدول ۱۲-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی

ژنهای اینتگراز ۵۲

عنوان صفحه

جدول ۱۳-۳: تهیه بافر TAE 50 بار ۵۳

جدول۱۴-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام PCR برای شناسایی کاست ژنی

کلاس۱ اینتگرون ۵۵

جدول ۱-۴: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی

بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز ۵۸

جدول ۲-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ در جدایه های E. coli

جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۵۹

جدول ۳-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۲ در جدایه های E. coli

جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۶۰

جدول ۴-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲

در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۶۱

جدول ۵-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور

همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲

جدول ۶-۴: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی

کلاس ۱ اینتگرون‌ها در محصولات PCR تعیین ترادف شده ۶۶

فهرست تصاویر

عنوان صفحه

تصویر ۱-۱ مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک ۱۹

تصویر ۲-۱ سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی

به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند ۲۱

تصویر۳-۱) ساختمان کلی یک اینتگرون ۲۴

تصویر۴-۱: ساختمان کلی کلاس۱ اینتگرون‌ها ۲۵

تصویر ۵-۱: ساختار کلاس ۱ اینتگرون‌ یافت شده در Tn402 26

تصویر۶-۱: ساختار اینتگرون کلاس۲ موجود در Tn7 26

تصویر۷-۱: ساختار اولین اینتگرون کلاس ۳ از ژاپن ۲۷

تصویر۸-۱: ساختار کاستها همراه اینتگرون ۲۸

تصویر۸-۱:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون ۲۹

تصویر۹-۱: مکانیسم ورود و بیان کاست‌های ژنی توسط اینتگرون کلاس۱ ۳۱

تصویر۱-۴: تصوی ژل الکتروفورز ۶۳

تصویر ۲-۴: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها

با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۴

تصویر ۳-۴: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها

با طول متفاوت پس از از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۵

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار۱-۴: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی

بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز. ۵۸

نمودار ۲-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ در جدایه های E. coli

بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه. ۵۹

نمودار ۳-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۲ در جدایه های E. coli

بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۰

نمودار ۴-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲

در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۱

نمودار ۵-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ و ژن اینتگراز ۲ و حضور

همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲

فصل اول: مقدمه و هدف

۱-۱- مقدمه

کشف آنتی بیوتیک ها در اواخر دهه‌‌ی ۱۹۲۰ و آغاز استفاده از آنها در درمان و جلوگیری از عفونت در دهه‌ی۱۹۴۰ بدون شک یکی از پیشرفت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های بزرگ پزشکی در ۱۰۰ سال گذشته است (دیویس، ۲۰۰۷، دیویس و دیویس، ۲۰۱۰). از آن زمان تا کنون آنتی‌بیوتیک‌ها به طور گسترده‌ای در درمان بیماری‌های عفونی انسانها و حیوانات استفاده شده‌اند. آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور به منظور افزایش رشد، درمان، پیشگیری و کوکسیدیواستات استفاده می‌شوند (گوآرداباسی و همکاران، ۲۰۰۸). استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در انسان و حیوانات سبب ایجاد نگرانی‌هایی در مورد توسعه‌ی باکتری‌ های مقاوم و نیز باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه که یک خطر بالقوه برای جوامع انسانی و حیوانات هستند، شده است، چرا که مقاومت می‌تواند سبب شکست در درمان شود (اریال، ۲۰۰۱).

بر طبق تخمین مرکز” کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) در ایالات متحده آمریکا سالانه در حدود ۶۰۰۰۰ نفر در کشور آمریکا به علت مقاومت عوامل بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها جان خود را از دست می دهند. همچنین تخمین زده می شود که استفاده غیر درمانی از آنتی بیوتیک ها در چارپایان اهلی ۸۰% از کل آنتی بیوتیک های استفاده شده در ایالات متحده را شامل می شود.

صنعت طیور دومین صنعت کشور ما محسوب می‌شود. با این حال به علت نبود سیستم نظارتی دقیق، آنتی‌بیوتیک‌ها به شکلی خودسرانه و غیر معقول درطیور صنعتی مصرف می‌شوند. مشکل مهمی که استفاده غیر اصولی از آنتی‌بیوتیک‌ها ایجاد می‌کند، بقایای این داروها در محصولات دامی، خصوصا گوشت ماکیان و تخم مرغ می‌باشد که علاوه بر انتقال به انسان و افزایش فشار بر کبد وکلیه‌ها برای دفع دارو، سبب ایجاد مقاومت در میکروارگانیسم‌های انسانی در اثر مواجهه آنها با این بقایای آنتی‌بیوتیکی می‌شود.

با ظهور باکتریهای مقاوم به چندین آنتی بیوتیک درمان عفونتها در سرتاسر جهان به خطر افتاده است. گرچه به صورت کلاسیک مقاومت را به جهش های کروموزومی نسبت می دهند. اما مقاومت غالبا در ارتباط با قطعات خارج کروموزومی است که از سایر باکتری‌های موجود در محیط کسب می شود که این‌ها شامل انواع مختلفی ازقطعات DNA متحرک، مثل پلاسمیدها، ترانسپوزونها و اینتگرونها هستند. به محض اینکه باکتری‌های دارای مقاومت مستقر شدند، دوام آورده و در سرتاسر جهان پخش می شوند و سبب شکست بالینی در درمان عفونتها و ایجاد بحرانهای بهداشت عمومی می‌شوند (الکسون و لوی، ۲۰۰۷). اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند (استوکس و هال، ۱۹۸۹). اینتگرونها عموما بر اساس توالی پروتئین اینتگراز که عملکرد نوترکیبی را به آنها می‌دهد، طبقه بندی می شوند. بر اساس این توالی اینتگرونهای مقاومت (RIs ) به ۵ دسته طبقه بندی شده اند ، که از میان آنها بیشترین حجم مطالعات بر روی کلاس ۱ و۲ و۳ انجام شده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی مختلف شناسایی شده است که سبب ایجاد مقاومت به (تقریبا) تمام آنتی بیوتیک ها می شوند (مازل، ۲۰۰۶). کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرون‌ها شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. بنابراین به این اینتگرونها، اینتگرون‌های مقاومت (RIs ^[۱]) یا اینتگرون‌های مقاومت چندگانه دارویی (MRIs ^[۲])گویند (استالدر و همکاران، ۲۰۱۲). ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند (لوراستین هال و همکاران، ۲۰۰۳).

مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از طریق عفونتهای منتقل شونده از راه غذا در نظر گرفته شده است. مسبب آن پاتوژن‌های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا ^[۳] مثل طیور به پاتوژنهای انسانی می‌باشد (باکس و همکاران، ۲۰۰۵). اینتگرونها در سرتاسر جهان در ارتباط با باکتری های گرم منفی توصیف شده اند و شاخصی برای مقاومت آنتی بیوتیکی هستند (باهو و همکاران، ۲۰۱۰).

کلاس یک اینتگرون‌ها به علت پخش وسیع در میان باکتریهای گرم منفی وبالاترین میزان گزارشات در انسان و حیوانات به طور گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته اند. این کلاس شایعترین اینتگرون در جدایه‌های کلینیکی است وسبب شده برخی نویسندگان آنها را اینتگرون‌های بالینی^[۴] نامگذاری کنند (گیلینگز و همکاران، ۲۰۰۸). کلاس ۲ اینتگرونهای متحرک ، دومین گروه فراوان اینتگرون‌ها هستند . در اغلب اینتگرونهای کلاس ۲ ژن intI2 بوسیله ی یک کدون پایان منقطع می‌شود که منجر به تولید یک پروتئین ناقص و غیر عملکردی می‌شود که باعث ایجاد یک ترتیب پایدار در کاست‌های ژنی می‌شود که اساسا شامل ژن مقاومت به تری متوپریم dfrA1 ،ژن مقاومت به استرپتو تریسین sat2 ، ژن مقاومت به استرپتومیسین و اسپکتینومیسین aadA1 و ژن با عملکرد نامشخص orfX هستند (هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). فشار آنتی بیوتیکی احتمالا نقش مهمی درانتخاب وپخش اینتگرونهای متحرک در باکتریها ایفا کرده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی که سبب مقاومت آنتی‌بیوتیکی می‌شوند و بیش از ۶۰ کاست ژنی با عملکرد نا شناخته در رابطه با اینتگرونهای متحرک شناسایی شده اند (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹). ژنهایی که درون این کاست های ژنی جاسازی شده اند شامل ژنهای مقاومت به تقریبا تمام خانواده‌های آنتی بیوتیکی، شامل: بتا-لاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها، تریمتوپریم، کلرآمفنیکل، فسفومیسین، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، ریفامپیسین و کوئینولون‌ها هستند. علاوه بر آن کاست‌های ژنیqac که فاکتورهای مقاومت به مواد ضد عفونی کننده از خانواده ترکیبات چهار تایی آمونیوم را رمزگردانی می‌کنند در اینتگرونهای متحرک یافت شده اند. مطالعات نشان داده اند که اینتگرونهای متحرک (MIs ) در جوامع باکتریایی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در کلینیک‌ها یا کشاورزی یا محیط در معرض فشار آنتی‌بیوتیکی قرار گرفته اند، شیوع بیشتری داشته است (استادر و همکاران، ۲۰۱۲).

از آن جهت که تا کنون پژوهشی در جهت شناسایی اینتگرون‌ها در باکتری‌های جدا شده از طیور گوشتی استان فارس انجام نشده و نقش آنها در ایجاد مقاومت‌های چندگانه در ماکیان استان بررسی نشده است و همچنین با توجه به نقش بسیار مهم اینتگرونها در شیوع مقاومت های آنتی بیوتیکی چندگانه در بین پاتوژنهای حیوانی و همچنین انسانی و انتقال باکتری‌های طیور از طریق زنجیره‌ی غذایی به انسان‌ها و نیز خطر انتقال فاکتورهای مقاومت از باکتری‌های ماکیان به سایر باکتری‌های موجود در محیط و باکتری‌های فلور حیوانات و انسان‌ها، به نظر می‌رسد نتایج این پایان نامه در خصوص تعیین حضور و فراوانی اینتگرون‌ها در جدایه‌های اشریشیا‌کولی طیور گوشتی منطقه منجر به کسب اطلاعات مفیدی در زمینه مکانیسم‌های انتقال مقاومت آنتی‌بیوتیکی و ایجاد باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه در باکتری‌های ماکیان خواهد شد.

۱-۲- فرضیه ها و اهداف طرح

آیا اینتگرونهای کلاس ۱و۲ در جدایه‌های E. coli طیور گوشتی مورد مطالعه وجود دارد؟

کدامیک از اینتگرونهای کلاس ۱و۲ بیشترین فراوانی را در جدایه‌های موجود دارند ؟

آیا میان حضور اینتگرونها و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در جدایه‌های مورد مطالعه ارتباطی وجود دارد ؟

فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود

۱-۲- اشریشیا کولی

باکتری اشریشیا کولی متعلق به جنس اشریشیا^[۵] از خانواده انتروباکتریاسه^[۶] می باشد. اشریشیا کولی یک باسیل گرم منفی، غیر اسیدفست، چند شکلی و غیر اسپورزا می‌باشد. اغلب سویه‌های این باکتری متحرک و دارای تاژک می‌باشند (کوئین و همکاران. ۱۹۹۴ب).

۱-۱-۲-خصوصیات کشت

اشریشیا کولی بصورت هوازی یا بی‌هوازی بر روی محیط کشت های معمولی و در بازه دمایی ۴۴-۱۸ درجه سانتی‌گراد رشد می‌کند. این باکتری بر روی پلیت‌های آگار در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در عرض ۲۴ ساعت رشد کرده و کلنی‌های صاف، محدب و بی‌رنگی را تولید می‌کند. کلنی‌های اشریشیا کولی بر روی آگار مک کانکی صورتی درخشان، بر روی آگار EMB ^[۷] سبز تیره با جلای فلزی دیده می‌شوند. اگرچه شکل کلنی‌های اشریشیا کولی متغیر است ولی معمولاَ mm 3-1 قطر داشته و دارای یک ساختار گرانوله و لبه‌های کامل می‌باشند. کلنی‌های خشن، بزرگ و دارای لبه‌های منظم هستند. درحالیکه کلنی‌های موکوئیدی بزرگتر بوده و خیس وچسبنده به نظر می‌رسند. برخلاف اشریشیا کولی‌های بیماریزای پستانداران که به طور معمول بر روی آگار خون دار ایجاد همولیز می‌کنند، همولیز چهره معمول اشریشیا کولی‌های بیماریزای طیور نیست (رودریگز و همکاران ۲۰۰۵).

۲-۱-۲-خصوصیات بیوشیمیایی

اشریشیا کولی از تخمیر گلوکز، مالتوز، مانیتول، زیلوز، گلیسرول، رامنوز، سوربیتول وآرابینوز اسید و گاز تولید می‌کند اما دکسترین، نشاسته و اینوزیتول را تخمیر نمی‌کند. جایگزینی سوربیتول به جای لاکتوز در آگار مک کانکی برای تفریق اشریشیا کولی O157 از دیگر جدایه های اشریشیا کولی بکار می رود زیراکه O157:H7 سوربیتول را تخمیر نکرده و نمی تواند بر روی مک کانکی کلنی‌های صورتی رنگ ایجاد کند (مارچ و رتنام، ۱۹۸۶). اغلب جدایه‌های اشریشیا کولی لاکتوز را تخمیر می‌کنند ولی برخی سویه‌های اشریشیا کولی لاکتوز منفی وجود دارند که می بایست از سالمونلا تفریق داده شوند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸ب). اشریشیا کولی اندول تولید کرده، واکنش متیل رد مثبت داشته و نیترات را به نیتریت تبدیل می‌کند. واکنش های ووژ- پروسکوئر^[۸] و اکسیداز آن منفی است و در محیط آهن دار سولفید هیدروژن تولید نمی‌کند. اشریشیا کولی در حضور سیانید پتاسیم رشد نمی‌کند. اوره را هیدرولیز کرده (اوره آز منفی است)، ژلاتین را ذوب و بر روی محیط سیترات رشد می‌کند. از آزمایش‌های بیوشیمیایی می‌توان برای تمایز اشریشیا کولی از دیگر گونه‌های جنس اشریشیا استفاده کرد (بتل هایم، ۱۹۹۴؛ جیلس، ۱۹۹۴).

۳-۱-۲-انتشار و راه های انتقال اشریشیا کولی در طیور

سروتیپ های مختلف اشریشیا کولی فلور نرمال روده بوده و در تعداد زیاد در دستگاه گوارش بسیاری از موجودات از جمله انسان دیده می‌شوند. حضور اشریشیا‌کولی در روده بسیار مفید بوده و می تواند از جایگزین شدن سایر باکتری ها مانند سالمونلا ممانعت کند (مورر و همکاران، ۲۰۰۲). باکتری‌های روده نقش مهمی در پاتوژنز بیماری‌های روده بازی می‌کنند، زیرا اعتقاد بر این است که آنها از روده در برابر کلونیزه شدن پاتوژنها جلوگیری می‌کنند و سبب تحریک پاسخ ایمنی در جوجه ها می‌شوند (مید، ۲۰۰۰). خوراک طیور می‌تواند به طور مستقیم یا غیر مستقیم از طریق تماس با خاک، جوندگان، پرندگان، گرد و غبار، انسان به عنوان حامل، فاضلاب یا آب در طول پردازش و ذخیره سازی آلوده شود. در تجزیه و تحلیل میکروبیولوژیکی مواد غذایی، اعضای انتروباکتریاسه به طور معمول به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی عمل می‌کنند و شامل باکتری‌های مهم مشترک انسان و دام مثل گونه‌های سالمونلا، گونه‌های یرسینیا و اشریشیا‌کولی هستند (میراندا و همکاران، ۲۰۰۸). در مطالعه‌ای به منظورجداسازی و شناسایی انتروباکتریاسه و غیر انتروباکتریاسه از دستگاه گوارش ماکیان در سطح جنس و گونه، نشان داده شد که شایع ترین انتروباکتریاسه موجود در نمونه‌ها اشریشیا کولی (۳۳/۵۸ %) بود (یهیا وهمکاران، ۲۰۱۳). در ماکیان نرمال، ۱۵-۱۰ درصد کلی‌فرم‌های روده‌ای ممکن است به سروتیپ های بالقوه پاتوژن تعلق داشته باشند (هری و همزلی، ۱۹۶۵ب). گرچه این سروتیپ‌های روده‌ای ممکن است مشابه سروتیپ‌های خارج روده‌ای بیماریزا در همان پرنده نباشند ولی می‌توانند به عنوان مخزنی برای فاکتورهای حدت و فاکتورهای مقاومت باکتریایی عمل کنند (نوگرادی و همکاران، ۲۰۰۶). باکتری‌های اشریشیا‌کولی‌ بیماریزا می توانند از طریق تخم مرغ منتقل شده وسبب مرگ و میر بالا در جوجه های جوان گردند (روزاریو و همکاران، ۲۰۰۴). کولی فرم های بیماریزا در روده جوجه‌های تازه از تخم در آمده بسیار فراوان تر از تخم مرغ هایی هستند که از آن ها تفریخ شده‌اند. این امر نشان دهنده گسترش سریع این سویه ها بلافاصله پس از تفریخ است (هری وهمزلی، ۱۹۶۵الف). به نظر می‌رسد که مهمترین منبع آلودگی تخم مرغ ها آلودگی مدفوعی سطح تخم مرغ ها باشد که از طریق پوسته تخم مرغ به داخل نفوذ می‌کند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸الف). دان مصرفی و سایر اجزاء جیره غذایی طیور اغلب به راحتی با کلی فرم های بیماریزا آلوده شده و منابع متداولی برای معرفی سروتیپ های جدید به گله های طیور محسوب می شوند (دا کوستا و همکاران، ۲۰۰۷). مدفوع جوندگان نیز محتوی سویه های بیماریزای اشریشیا‌کولی می‌باشد. دستگاه گوارش موش ها محیط مناسبی برای انتقال ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی از سویه‌های مقاوم به سویه‌های حساس است (هارت و همکاران، ۲۰۰۶). سروتیپ های بیماریزا ممکن است که از طریق آب چاه آلوده به گله های طیور منتقل شوند. حضور اشریشیا کولی در آب آشامیدنی نشان دهنده آلودگی مدفوعی بوده و می تواند نشانگر انتقال مدفوعی-دهانی عامل بیماریزا باشد (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸الف).

۲-۲-آنتی‌بیوتک‌ها

۱-۲-۲- تعریف

آنتی‌بیوتیک‌ها عواملی هستند که با کشتن یا مهار رشد سلول‌های باکتریایی بر آنها اثر می‌گذارند. آنها محصولات فرعی طبیعی ارگانیسم‌هایی مثل باکتری‌ها و قارچ ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ها هستند. واژه آنتی‌بیوتیک در اصل فقط آن دسته از ترکیبات مشتق شده از منشاء میکروبی را توصیف می‌کند، با این حال در حال حاضر این تعریف شامل هر ترکیب با وزن مولکولی کم می‌شود که یا از میکروب‌ها یا از سایر موجودات زنده و یا حتی از منشاء نیمه سنتزی یا مصنوعی است که می‌تواند رشد میکروارگانیسم‌های دیگر را مهار و یا آنها را نابود کند. اکثریت آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده در طب انسانی و دامپزشکی محصولات طبیعی تولید شده توسط سه گروه اصلی از میکروارگانیسم ها شامل: اکتینومایست‌ها، باکتریها و قارچ های رشته‌ای، هستند. اکتینومایست‌ها بیشترین تعداد و بیشترین انواع آنتی بیوتیک‌ها را تولید می‌کنند (بیش از شش هزار ماده از آن‌ها جدا شده) (کیز وهمکاران، ۲۰۰۸). آنتی‌بیوتیک‌ها برای درمان بیماری و عفونت، به منظور پیشگیری در جراحی‌ها، به عنوان بهبود دهنده‌ی رشد در مزارع پرورشی، به عنوان درمان‌های پیشگیرانه در کشاورزی و برای تحقیقات در میکروبیولوژی و زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شوند (دیویس، ۱۹۹۰).

۲-۲-۲-سابقه تاریخی

با ابداع پنی‌سیلین و داروهای سولفونامیدی و استفاده‌‌ی بالینی آنها به ترتیب در دهه ‌ها‌ی ۱۹۳۰و۱۹۴۰ میلادی (کوهن، ۲۰۰۰) درمان بیماری‌های عفونی پیشرفت کرد. موفقیت بالینی این داروها و نیاز به درمان عفونت های باکتریایی در زخمهای ایجاد شده در اثر جنگ در خلال جنگ جهانی دوم منجر به کشف آنتی‌بیوتیک‌های مختلف از جمله استرپتومایسین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین، اریترومایسین، ریفامایسین، وانکومایسین و سفالوسپورین ها بین سال های ۱۹۴۰و۱۹۶۰ شد (یونیاماتا و کاتسوماتا، ۲۰۰۶). تاثیر قابل توجه آنتی‌بیوتیک‌ها منجر به خوشبینی برای درمان بیماری‌های عفونی شد. اما باکتری‌ها بلافاصله پس از استفاده از هر داروی جدید مقاومت علیه آنرا ظاهر کردند وسبب ظهور مجدد عفونت‌هایی شدندکه سابقا تجربه شده بود و به نظر می‌رسید این بار بدخیم‌تر شده باشند (کوهن، ۲۰۰۰).

۳-۲-۲-طبقه بندی آنتی‌بیوتیک ها

دسته‌ه ای متفاوتی از آنتی‌بیوتیک‌ها وجود دارند که هر کدام قسمت متفاوتی از سیستم رشد سلول باکتری را هدف قرار می‌دهند. این مواد یا باکتریواستاتیک یا باکتریوسیدال هستند. بتا-لاکتام‌ها و سفالوسپورین‌ها آنتی‌بیوتیک‌های باکتریوسیدال هستند که سنتز دیواره سلولی را مهار می‌کنند (تیورتزباکر، ۱۹۹۸). آنها سبب غیر فعال شدن پروتئین‌های باند‌شونده به پنی‌سیلین^[۹] می‌شوند که این پروتئین‌ها، آنزیم‌هایی هستند که در اتصالات عرضی پپتیدوگلیکان^[۱۰] دخیل هستند. این آنتی‌بیوتیک‌ها فقط سلول‌های در حال رشد را می‌کشند. تتراسایکلین ها عوامل باکتریواستاتیکی هستند که با اتصال به زیرواحد ۳۰S ریبوزومی ومهار اتصال tRNAحامل اسید‌آمینه مانع از سنتز پروتئین می‌شوند (تیلور و چاو، ۱۹۹۶). آمینوگلیکوزیدها دسته‌ای از آنتی‌بیوتیک‌ها با طیف گسترده‌ای از اعضاء هستند که با اتصال به زیرواحد ۳۰S ریبوزومی و ایجاد اشتباه در خواندن mRNA سنتز پروتئین را مهار می‌کنند (رکیا و هال، ۱۹۹۵ب). کینولون ها، عوامل ضد میکروبی باکتریوسیدال هستند که از طریق تعامل با DNA gyrase و توپوایزومراز، سبب مهار فعالیت آنزیمی و مهار باز شدن رشته‌های در هم پیچیده DNA شده و همانند‌سازی DNA را مهار می‌کنند (هوپر، ۱۹۹۹). کلرامفنیکل با اتصال به زیرواحد ۵۰S ریبوزومی و اثر مهاری بر peptidyltransferase دارد سبب مهار سنتز پروتئین می‌شود (موری و شاو، ۱۹۹۷).

طبقه‌ بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر به طور خلاصه در جدول زیر آورده شده است.

جدول۱-۱: طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر (طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها و مکانیسم عمل آنها، ۲۰۱۳)

Antibiotic Grouping By Mechanism

Cell Wall Synthesis

Penicillins
Cephalosporins
Vancomycin
Beta-lactamase Inhibitors
Carbapenems
Aztreonam
Polymycin
Bacitracin

Protein Synthesis Inhibitors

Inhibit 30s Subunit
Aminoglycosides (gentamicin)
Tetracyclines
Inhibit 50s Subunit
Macrolides
Chloramphenicol
Clindamycin
Linezolid
Streptogramins

DNA Synthesis Inhibitors

Fluoroquinolones

RNA synthesis Inhibitors

Rifampin

Mycolic Acid synthesis inhibitors

Isoniazid

Folic Acid synthesis inhibitors

Sulfonamides
Trimethoprim

۴-۲-۲- استفاده از آنتی بیوتیک در حیوانات مولد غذا^[۱۱]

استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در حیوانات مولد غذا مدت کوتاهی پس از جنگ جهانی دوم آغاز شد. مور و همکاران پیشنهاد کردند که آنتی‌بیوتیک‌ها در آب و غذای حیوانات استفاده شوند، زیرا به نظر می‌رسید آنها سرعت رشد ماکیان را ارتقا می بخشند (مور و همکاران، ۱۹۴۶). از آن زمان، پژوهش‌های بعدی به گزارش مزایای دوزهای تحت درمانی آنتی‌بیوتیک‌ها (که توسط سازمان غذا و داروی آمریکا کمتر از ۲۰۰ گرم در هر تن غذا معین شده) که در حیوانات متفاوت از جمله خوک وگاو آزمایش شده بود، پرداخت (کانها و همکاران، ۱۹۵۰؛ لوسلی و والاس، ۱۹۵۰؛ پرسکات، ۲۰۰۶). این مکانیسم که چگونه آنتی‌بیوتیک‌ها سبب بهبود سرعت رشد و بازده خوراک می‌شوند هرگز به خوبی درک نشده است. با این حال نظریه‌های متعددی پیشنهاد شده است از جمله: ۱) اثرات بیوشیمیایی که شامل دفع نیتروژن، افزایش بهره وری وراندمان در فسفوریلاسیون سلولها و سنتز پروتئین ۲) اثرات آنتی‌بیوتیک‌ها روی تولید ویتامین‌ها وکوفاکتورهای ضروری توسط میکروفلور روده و ۳) کاهش در جمعیت ارگانیسم‌های بیماریزای تحت بالینی (کرامول، ۱۹۹۱). همچنین استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها سبب کاهش تولید کود و در نتیجه کاهش اثرات ضایعات حیوانی بر محیط زیست شده (راث و کرشجسنر، ۱۹۹۳) و کاهش بار پاتوژن حیوانات و کاهش حمل پاتوژن های منتقله از طریق غذا^[۱۲] در دام‌ها را سبب می‌شود (ابنر و متیو، ۲۰۰۰؛ کریاکیس و همکاران، ۱۹۹۶). بسیاری از پاتوژن های منتقل شده از طریق غذا به راحتی با واکسیناسیون در دام‌ها قابل کنترل نیست و چون این موجودات ارتباط همسفرگی با میزبان خود (حیوانات مولد غذا) دارند ریشه‌کن کردن آنها اگر غیرممکن نباشد، دشوار است. با این حال، محدود کردن تعداد آنها در روده با غذاهای مبتنی برآنتی بیوتیک ها یا افزودن آنتی‌بیوتیک‌ها به صورت مکمل های آب ممکن است یک رویکرد عملی برای محدود کردن انتقال این ارگانیسم ها‌ی قابل انتقال با غذا باشد (فیلیپس و همکاران، ۲۰۰۴). در دامداری، استفاده از آنتی‌بیوتیک به ۴ هدف انجام می‌شود (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱) در مرحله اول، درمانی است که در نظر دارد عفونت باکتریایی موجود را با درمان حیوانات آلوده کنترل کند. دوم، اقدام درمانی که هدف آن درمان حیوانات آلوده و همچنین دارو دادن به حیوانات دیگر برای هدف پیشگیری است. سوم، درمان پیشگیری است که در طول دوره خطر بالای سرایت عفونت به عنوان یک اقدام پیشگیرانه اعمال می شود اما حیوانات بیمار را درمان نمی‌کنند (مثلا هنگام جابجایی یا از شیرگیری دام). و در نهایت، استفاده از عوامل آنتی بیوتیکی برای هدف ارتقاء رشد.

تتراسایکلین، پنی سیلین، اریترومایسین و سایر داروهای مورد استفاده در طب انسانی به طور گسترده در پرورش حیوانات مولد غذا استفاده می‌شوند. یک مطالعه که توسط دانشمندان در سال ۲۰۰۱ منتشر شد بیان کرد که حدود ۶/۲۴ میلیون پوند آنتی‌بیوتیک در حیوانات استفاده می‌شود، که بخش عمده آن مربوط به استفاده آنها در تولید ماکیان است که از دهه ۱۹۸۰ افزایش چشمگیر ۳۰۷ درصدی داشته است. برآوردهای آنها عنوان کرد که استفاده‌ی غیر درمانی در دامها ۷۰ درصد کل استفاده آنتی‌بیوتیکی را شامل می‌شود (ملون و همکاران، ۲۰۰۱). آمار و ارقام بدست آمده درمطالعه‌ی این دانشمندان بر اساس روش های غیر مستقیم و تعمیم دهی^[۱۳] بوده است و برآورد میزان دقیق آنتی‌بیوتیک‌ها برای حیوانات هنوز هم نیاز به روشن کردن این نکته دارد که داروها برای چه منظور و در چه مقدار استفاده می شود.

۱-۴-۲-۲-مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در طیور

به طور کلی آنتی بیوتیک ها در صنعت طیور برای اهداف درمانی، غیردرمانی و ارتقاء رشد استفاده می‌شود (سی وی پی، ۲۰۰۶؛ لو و همکاران، ۲۰۰۶)

امروزه تولید جوجه های گوشتی بسیار نظام‌مند و متراکم شده است. این ادغام منجر به نیاز به شیوه های استاندارد از جمله روش های درمان دارویی برای به حداقل رساندن عفونت در میان گله شده است. آنتی‌بیوتیکها معمولا از طریق آب و غذا به کل گله ماکیان تجویز می‌شود چرا که درمان‌های فردی عملی نیست. برای مثال، آنتی بیوتیک‌هایی از قبیل یونوفورها و سولفونامیدها که برای کنترل کوکسیدیوز (یک بیماری انگلی که بوسیله‌ی تک یاخته کوکسیدیا ایجاد می‌شود) استفاده می شوند در جیره جوجه های گوشتی موجود می‌باشد. باسیتراسین، کلرتتراسایکلین، پنی سیلین، ویرجینیامایسین و ترکیبات آرسنیک در جهت ارتقاء رشد و بازده خوراک در جوجه های گوشتی، بوقلمون ها، و طیور تخمگذار تایید شده‌اند (ان آر سی، ۱۹۹۹). تولید مرغ گوشتی تقریبا همیشه شامل مصرف یک کوکسیدیواستات، ترکیب آرسنیکی و یک آنتی بیوتیک برای بهبود بازده خوراک و افزایش وزن بدن و کاهش عوارض و مرگ و میر می‌باشد (ان آر سی، ۱۹۹۹). آنتی بیوتیک های محرک رشد مورد استفاده در تولید طیور در ایالات متحده شامل کلرتتراسایکلین، باسیتراسین، تایلوزین، بامبرمایسین و ویرجینیامایسین می‌باشد (سی وی پی،۲۰۰۶). بیماری های باکتریایی، از جمله کلی‌باسیلوز، انتریت ناشی از گونه‌های کلستریدیوم، مایکوپلاسموزیس، و انواع مختلفی از سالمونلوز، باعث ضررهای اقتصادی قابل توجهی به صنعت طیور می‌شوند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸ب) و دلیل اصلی برای درمان آنتی‌بیوتیکی در طیور هستند (سینگر و هوفکر،۲۰۰۶) آنتی بیوتیک های متداول مورد استفاده برای کنترل این ارگانیسم‌ها شامل سولفونامیدها، آموکسی سیلین، تتراسیکلین، ویرجینیامایسین، تایلوزین، نئومایسین، و پنی سیلین هستند. تا همین اواخر، انروفلوکساسین، داروی فلوروکینولونی، برای کنترل کلی‌باسیلوز مورد تائید بود. با این حال، نگرانی در مورد اینکه استفاده از فلوروکینولون‌ها در طیور ممکن است با عفونت کمپیلوباکتر مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک در انسان مرتبط باشد (پیداک، ۱۹۹۵؛ مورفی و همکاران،۱۹۹۶؛ چو و همکاران،۲۰۰۴) سبب شد سازمان غذا و داروی آمریکا در سال ۲۰۰۵ استفاده از این دارو را در طیور ممنوع کند (اف دی آ، ۲۰۰۵). تخم مرغ‌های نطفه‌دار نیز ممکن است برای کاهش آلودگی به مایکوپلاسما و باکتری‌ها در جنتامایسین غوطه ور شوند (مک یووین و فدورکا-کری، ۲۰۰۲).

پیامدهای استفاده از آنتی بیوتیک ها در حیوانات مولد غذا

مطالعات نشان می‌دهد آنتی‌بیوتیک‌هایی که در حیوانات مولد غذا استفاده می شوند باکتری‌های مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک همزیست، از جمله انتروکوکوس و اشریشیا‌کولی غیرپاتوژن و عوامل آنتروپاتوژن‌های مشترک انسان و دام مانند سالمونلا، کامپیلوباکتر، یرسینیا و اشریشیا‌کولی پاتوژن را انتخاب می‌کند (لینتون و همکاران ۱۹۷۵؛ لوی و همکاران، ۱۹۷۶؛ انتز وهمکاران، ۱۹۹۱؛ لو و همکاران،۱۹۹۷). در هر حال، آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا فشار انتخابی را فراهم می‌کند که باکتری‌ها را وادار به توسعه‌ی مکانیسم‌های مقاومت کرده و آشکارا به انتشار مقاومت آنتی بیوتیکی در میان باکتری ها کمک می‌کند.

از آنجا که بسیاری از آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا متعلق به گروههایی از آنتی بیوتیکها هستند که در طب انسانی مورد استفاده قرار می گیرد، ظهور باکتریهای مقاوم به آنتی‌بیوتیک، به نگرانی ویژه ای در سلامت مواد غذایی تبدیل شده است (شی، ۲۰۰۳). سویه های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک آنتروپاتوژن های مشترک انسان و دام و همچنین سویه‌های همزیست به احتمال زیاد از طریق زنجیره غذایی به انسان منتقل می‌شوند. هولمبرگ وهمکاران در سال ۱۹۸۴ گزارش کردند که عفونت سالمونلایی با مصرف همبرگر آلوده به سالمونلا انتریکا سرووار نیوپورت مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی سیلین، کاربنیسیلین، و تتراسایکلین، ارتباط داشت. منشاء پاتوژن‌های مسبب به گوشت گاوهایی در داکوتای جنوبی برمی‌گشت که با دوز تحت درمانی^[۱۴] از کلرتتراسایکلین به عنوان محرک رشد تغذیه شده بودند. درمان آنتی بیوتیکی در طول کلونیزه شدن باکتریهای مقاوم به آنتی بیوتیک، ممکن است سبب پیشرفت به حالت بیماری بالینی شود. اثرات انتخابی ارائه شده توسط آنتی بیوتیک های تجویز شده در درمان دارویی، یک مزیت خاص برای برخی از پاتوژن‌های مقاوم ایجاد می‌کند تا رشد بیشتری نسبت به میکروفلور دستگاه گوارش داشته باشند (هملمبرگ و همکاران، ۱۹۸۴). در سال ۲۰۰۱ در هلند نسبت باکتری‌های اشریشیا‌کولی مدفوعی مقاوم در طیورگوشتی و بوقلمون و مرغان تخم گذار که به جیره آنها آنتی بیوتیک اضافه شده بود و درنمونه‌های مدفوعی پرورش دهندگان طیور گوشتی، بوقلمون و مرغان تخم گذار وکشتار کنندگان طیور گوشتی و بوقلمون تعیین شد که نتایج آن حاکی ازانتقال مقاومت از طیور به انسان بودند (ون دن بوگارد و همکاران، ۲۰۰۱). مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از راه عفونتهای منتقل شونده از غذا^[۱۵] در نظر گرفته شده که یا پاتوژن های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرون‌ها از باکتری‌های موجود در حیوانات تولید کننده غذا ) food-producing animals مثل طیور) به پاتوژنهای انسانی مسبب آن است (باکس و همکاران، ۲۰۰۵).

افزایش سطح مقاومت باکتریایی درمان آنتی بیوتیکی را کمتر موثر می سازد. شکست درمان به علت افزایش مقاومت سالمونلا به فلوروکینولون‌ها مانند سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید از دهه‌ی۱۹۹۰ گزارش شده است (موری و همکاران، ۲۰۰۵). درمان عفونت ایجاد شده با سویه‌های باکتریایی مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با توجه به انتخاب محدود درمانی پس از تشخیص و افزایش حدت سویه‌های دارای مقاومت آنتی بیوتیکی، سخت تر می شوند (مالباک، ۲۰۰۶)

باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با منشاء حیوانی می تواند سبب بیماری‌های جدی در انسان وشکست در درمان دارویی هم در دامپزشکی وهم در طب انسانی شود، بنابراین استفاده محتاطانه‌تر از آنتی‌بیوتیک‌ها برای کنترل ظهور و گسترش پاتوژن های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک مورد نیاز است.

انتقال باکتری‌های حامل ژنهای مقاومت از طریق غذا محتمل‌ترین راهی است که از طریق آن استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در کشاورزی می تواند بر سلامت انسان تاثیر گذارد. با این حال، برخی از شواهد برای انتقال مستقیم باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک از حیوانات به انسان گزارش شده است (هومل و همکاران، ۱۹۸۶؛ هانتر و همکاران،۱۹۹۴؛ باکس و همکاران،۲۰۰۵؛ جانسون و همکاران، ۲۰۰۷).

بنابراین انتقال ژنهای مقاومت واینتگرونها ی حاوی مقاومت های چندگانه که دراثر مصرف بی رویه آنتی بیوتیکها ایجاد شده اند، ازباکتریهای فلور به انواع پاتوژن، خطر بالقوه ای برای سلامت ماکیان محسوب می شودکه از طریق بی اثر کردن آنتی بیوتیکهای موجود باعث تحمیل هزینه های درمانی زیاد به مرغداران و افزایش تلفات ماکیان شده که منجر به بالا رفتن قیمت نهایی مرغ شده و می تواند سبب خسارات جدی به صنعت طیور و آسیب به چرخه ی اقتصادی کشور شود، همچنین خطر بهداشت عمومی و انتقال این ژنها به پاتوژنهای انسانی، درمان عفونتهای انسانی را باشکست مواجه خواهد کرد وسبب بی اثر شدن طیف وسیعی از آنتی بیوتیکهای موثر جدید و رایج می شود.

۵-۲-۲- منشاء مقاومت به آنتی بیوتیک

این موضوع به خوبی شناخته شده است که تعدادی از گونه های باکتریایی و قارچی دارای توانایی تولید ترکیبات آنتی بیوتیک هستند که به طور معمول برای به دست آوردن مزیت رقابت در محیط های غنی از میکروارگانیسم، از جمله خاک و بیوفیلم می‌باشد (آمابیلی-کوئواس و شیکیورل، ۱۹۹۲). پس این احتمال وجود دارد که آنتی بیوتیک‌های طبیعی بسیار پیش از آنکه اولین عوامل آنتی بیوتیکی به استفاده بالینی معرفی شوند در محیط زیست موجود بوده‌اند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱). مقاومت آنتی بیوتیکی نیز به احتمال زیاد در طبیعت قبل از استفاده انسان از مواد دارویی، پدید آمده است، زیرا ارگانیسم های تولیدکننده ترکیبات آنتی‌بیوتیکی نیاز به وسیله‌ای برای زنده ماندن در حضور محصولات خود داشتند، و گونه های رقیب نیز راه هایی برای مقابله با اثرات این ترکیبات یافتند (دیویس، ۱۹۹۷). بنابراین، برخی از ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به احتمال زیاد بسیار پیش از ظهور انسان، طب مدرن، و استفاده از آنتی‌بیوتیک ها در کشاورزی بوجود آمده‌اند.

۶-۲-۲- مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیک

دو مورد از رایجترین معیارهای مورد استفاده برای توصیف مقاومت آنتی بیوتیکی بر اساس فاکتورهای میکروبیولوژیکی (مقاومت آزمایشگاهی) و بالینی (مقاومت در بدن) استوار است (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶). برای تعریف میکروبیولوژیکی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف شده که دیگر توسط حداقل غلظت مهاری آن آنتی بیوتیک^[۱۶] که مانع از رشد سویه های معمولی آن گونه می‌شود، مهار نشود (گرین وود، ۱۹۹۵) با این حال، برای تعاریف بالینی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف می‌شود که تحت درمان دارویی، زنده باقی بماند (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶). اما به طور معمول مراد از مقاومت نوع آزمایشگاهی آن بوده و ملاک ما هم در این پایان نامه بر مبنای آن است زیرا نوع بالینی آن به فاکتورهای متعددی از قبیل دوزاژ، نحوه تجویز، توزیع بافتی دارو و وضعیت ایمنی بیمار بستگی دارد.

سلول های باکتریایی با بهره گرفتن از مکانیسم های مختلفی در برابر اثرات آنتی بیوتیک ها مقاومت می‌کنند. مقاومت به داروهای ضد میکروبی در باکتری ها می تواند ذاتی به دلیل مکانیسم عمل دارو یا اکتسابی باشد. حالت اکتسابی نوعی است که می تواند انتشار یابد و باعث افزایش مشکلاتی شود که امروزه جامعه پزشکی با آن مواجه است (رایس و بونومو، ۲۰۰۵).

رایجترین مکانیسم های مقاومت عبارتند از:

۱-۶-۲-۲- تغییر یا جایگزینی اهداف دارو

با تغییر یا جایگزینی گیرنده هدف، آنتی بیوتیک دیگر متصل نمی شود و به همین دلیل اثر مد نظر را ندارد. این روش تقریبا برای مکانیسم های مقاومت تمام گروه های آنتی بیوتیکی مرتبط است. تاکنون آشکار شده است که این راه برای مقاومت به پنی سیلین، گلیکولیپیدها، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، واسترپتوگرامین‌ها (MLS) در باکتری‌های گرم مثبت، و برای مقاومت به کینولون ها در هر دوگروه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، حائز اهمیت است. متیلاسیون هدف دارو، جهش ریبوزوم (برای مقاومت در برابر آمینوگلیکوزید و MLS) و جهش ژن مربوط به آنزیم باکتریایی که دارو آنرا هدف قرار داده است در مورد مقاومت به کینولون نمونه هایی از تغییر هدف هستند. مقاومت به گلیکوپپتیدها در انتروکوکسی‌ها و مقاومت به متی‌سیلین در استافیلوکوکوس اورئوس نمونه‌هایی از جایگزینی

جدول ۵-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲
جدول ۶-۴: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی
کلاس ۱ اینتگرون‌ها در محصولات PCR تعیین ترادف شده ۶۶
فهرست تصاویر

عنوان صفحه

تصویر ۱-۱ مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک ۱۹
تصویر ۲-۱ سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی
به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند ۲۱
تصویر۳-۱) ساختمان کلی یک اینتگرون ۲۴
تصویر۴-۱: ساختمان کلی کلاس۱ اینتگرون‌ها ۲۵
تصویر ۵-۱: ساختار کلاس ۱ اینتگرون‌ یافت شده در Tn402 26
تصویر۶-۱: ساختار اینتگرون کلاس۲ موجود در Tn7 26
تصویر۷-۱: ساختار اولین اینتگرون کلاس ۳ از ژاپن ۲۷
تصویر۸-۱: ساختار کاستها همراه اینتگرون ۲۸
تصویر۸-۱:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون ۲۹
تصویر۹-۱: مکانیسم ورود و بیان کاست‌های ژنی توسط اینتگرون کلاس۱ ۳۱
تصویر۱-۴: تصوی ژل الکتروفورز ۶۳
تصویر ۲-۴: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها
با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۴
تصویر ۳-۴: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها
با طول متفاوت پس از از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۵
فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار۱-۴: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی
بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز. ۵۸
نمودار ۲-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ در جدایه های E. coli
بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه. ۵۹
نمودار ۳-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۲ در جدایه های E. coli
بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۰
نمودار ۴-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲
در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۱
نمودار ۵-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ و ژن اینتگراز ۲ و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲

فصل اول: مقدمه و هدف

۱-۱- مقدمه

کشف آنتی بیوتیک ها در اواخر دهه‌‌ی ۱۹۲۰ و آغاز استفاده از آنها در درمان و جلوگیری از عفونت در دهه‌ی۱۹۴۰ بدون شک یکی از پیشرفت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های بزرگ پزشکی در ۱۰۰ سال گذشته است (دیویس، ۲۰۰۷، دیویس و دیویس، ۲۰۱۰). از آن زمان تا کنون آنتی‌بیوتیک‌ها به طور گسترده‌ای در درمان بیماری‌های عفونی انسانها و حیوانات استفاده شده‌اند. آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور به منظور افزایش رشد، درمان، پیشگیری و کوکسیدیواستات استفاده می‌شوند (گوآرداباسی و همکاران، ۲۰۰۸). استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در انسان و حیوانات سبب ایجاد نگرانی‌هایی در مورد توسعه‌ی باکتری‌ های مقاوم و نیز باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه که یک خطر بالقوه برای جوامع انسانی و حیوانات هستند، شده است، چرا که مقاومت می‌تواند سبب شکست در درمان شود (اریال، ۲۰۰۱).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

بر طبق تخمین مرکز” کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) در ایالات متحده آمریکا سالانه در حدود ۶۰۰۰۰ نفر در کشور آمریکا به علت مقاومت عوامل بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها جان خود را از دست می دهند. همچنین تخمین زده می شود که استفاده غیر درمانی از آنتی بیوتیک ها در چارپایان اهلی ۸۰% از کل آنتی بیوتیک های استفاده شده در ایالات متحده را شامل می شود.
صنعت طیور دومین صنعت کشور ما محسوب می‌شود. با این حال به علت نبود سیستم نظارتی دقیق، آنتی‌بیوتیک‌ها به شکلی خودسرانه و غیر معقول درطیور صنعتی مصرف می‌شوند. مشکل مهمی که استفاده غیر اصولی از آنتی‌بیوتیک‌ها ایجاد می‌کند، بقایای این داروها در محصولات دامی، خصوصا گوشت ماکیان و تخم مرغ می‌باشد که علاوه بر انتقال به انسان و افزایش فشار بر کبد وکلیه‌ها برای دفع دارو، سبب ایجاد مقاومت در میکروارگانیسم‌های انسانی در اثر مواجهه آنها با این بقایای آنتی‌بیوتیکی می‌شود.
با ظهور باکتریهای مقاوم به چندین آنتی بیوتیک درمان عفونتها در سرتاسر جهان به خطر افتاده است. گرچه به صورت کلاسیک مقاومت را به جهش های کروموزومی نسبت می دهند. اما مقاومت غالبا در ارتباط با قطعات خارج کروموزومی است که از سایر باکتری‌های موجود در محیط کسب می شود که این‌ها شامل انواع مختلفی ازقطعات DNA متحرک، مثل پلاسمیدها، ترانسپوزونها و اینتگرونها هستند. به محض اینکه باکتری‌های دارای مقاومت مستقر شدند، دوام آورده و در سرتاسر جهان پخش می شوند و سبب شکست بالینی در درمان عفونتها و ایجاد بحرانهای بهداشت عمومی می‌شوند (الکسون و لوی، ۲۰۰۷). اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند (استوکس و هال، ۱۹۸۹). اینتگرونها عموما بر اساس توالی پروتئین اینتگراز که عملکرد نوترکیبی را به آنها می‌دهد، طبقه بندی می شوند. بر اساس این توالی اینتگرونهای مقاومت (RIs ) به ۵ دسته طبقه بندی شده اند ، که از میان آنها بیشترین حجم مطالعات بر روی کلاس ۱ و۲ و۳ انجام شده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی مختلف شناسایی شده است که سبب ایجاد مقاومت به (تقریبا) تمام آنتی بیوتیک ها می شوند (مازل، ۲۰۰۶). کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرون‌ها شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. بنابراین به این اینتگرونها، اینتگرون‌های مقاومت (RIs ^[۱]) یا اینتگرون‌های مقاومت چندگانه دارویی (MRIs ^[۲])گویند (استالدر و همکاران، ۲۰۱۲). ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند (لوراستین هال و همکاران، ۲۰۰۳).
مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از طریق عفونتهای منتقل شونده از راه غذا در نظر گرفته شده است. مسبب آن پاتوژن‌های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا ^[۳] مثل طیور به پاتوژنهای انسانی می‌باشد (باکس و همکاران، ۲۰۰۵). اینتگرونها در سرتاسر جهان در ارتباط با باکتری های گرم منفی توصیف شده اند و شاخصی برای مقاومت آنتی بیوتیکی هستند (باهو و همکاران، ۲۰۱۰).
کلاس یک اینتگرون‌ها به علت پخش وسیع در میان باکتریهای گرم منفی وبالاترین میزان گزارشات در انسان و حیوانات به طور گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته اند. این کلاس شایعترین اینتگرون در جدایه‌های کلینیکی است وسبب شده برخی نویسندگان آنها را اینتگرون‌های بالینی^[۴] نامگذاری کنند (گیلینگز و همکاران، ۲۰۰۸). کلاس ۲ اینتگرونهای متحرک ، دومین گروه فراوان اینتگرون‌ها هستند . در اغلب اینتگرونهای کلاس ۲ ژن intI2 بوسیله ی یک کدون پایان منقطع می‌شود که منجر به تولید یک پروتئین ناقص و غیر عملکردی می‌شود که باعث ایجاد یک ترتیب پایدار در کاست‌های ژنی می‌شود که اساسا شامل ژن مقاومت به تری متوپریم dfrA1 ،ژن مقاومت به استرپتو تریسین sat2 ، ژن مقاومت به استرپتومیسین و اسپکتینومیسین aadA1 و ژن با عملکرد نامشخص orfX هستند (هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). فشار آنتی بیوتیکی احتمالا نقش مهمی درانتخاب وپخش اینتگرونهای متحرک در باکتریها ایفا کرده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی که سبب مقاومت آنتی‌بیوتیکی می‌شوند و بیش از ۶۰ کاست ژنی با عملکرد نا شناخته در رابطه با اینتگرونهای متحرک شناسایی شده اند (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹). ژنهایی که درون این کاست های ژنی جاسازی شده اند شامل ژنهای مقاومت به تقریبا تمام خانواده‌های آنتی بیوتیکی، شامل: بتا-لاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها، تریمتوپریم، کلرآمفنیکل، فسفومیسین، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، ریفامپیسین و کوئینولون‌ها هستند. علاوه بر آن کاست‌های ژنیqac که فاکتورهای مقاومت به مواد ضد عفونی کننده از خانواده ترکیبات چهار تایی آمونیوم را رمزگردانی می‌کنند در اینتگرونهای متحرک یافت شده اند. مطالعات نشان داده اند که اینتگرونهای متحرک (MIs ) در جوامع باکتریایی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در کلینیک‌ها یا کشاورزی یا محیط در معرض فشار آنتی‌بیوتیکی قرار گرفته اند، شیوع بیشتری داشته است (استادر و همکاران، ۲۰۱۲).
از آن جهت که تا کنون پژوهشی در جهت شناسایی اینتگرون‌ها در باکتری‌های جدا شده از طیور گوشتی استان فارس انجام نشده و نقش آنها در ایجاد مقاومت‌های چندگانه در ماکیان استان بررسی نشده است و همچنین با توجه به نقش بسیار مهم اینتگرونها در شیوع مقاومت های آنتی بیوتیکی چندگانه در بین پاتوژنهای حیوانی و همچنین انسانی و انتقال باکتری‌های طیور از طریق زنجیره‌ی غذایی به انسان‌ها و نیز خطر انتقال فاکتورهای مقاومت از باکتری‌های ماکیان به سایر باکتری‌های موجود در محیط و باکتری‌های فلور حیوانات و انسان‌ها، به نظر می‌رسد نتایج این پایان نامه در خصوص تعیین حضور و فراوانی اینتگرون‌ها در جدایه‌های اشریشیا‌کولی طیور گوشتی منطقه منجر به کسب اطلاعات مفیدی در زمینه مکانیسم‌های انتقال مقاومت آنتی‌بیوتیکی و ایجاد باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه در باکتری‌های ماکیان خواهد شد.

۱-۲- فرضیه ها و اهداف طرح

آیا اینتگرونهای کلاس ۱و۲ در جدایه‌های E. coli طیور گوشتی مورد مطالعه وجود دارد؟
کدامیک از اینتگرونهای کلاس ۱و۲ بیشترین فراوانی را در جدایه‌های موجود دارند ؟
آیا میان حضور اینتگرونها و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در جدایه‌های مورد مطالعه ارتباطی وجود دارد ؟

فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود

۱-۲- اشریشیا کولی

باکتری اشریشیا کولی متعلق به جنس اشریشیا^[۵] از خانواده انتروباکتریاسه^[۶] می باشد. اشریشیا کولی یک باسیل گرم منفی، غیر اسیدفست، چند شکلی و غیر اسپورزا می‌باشد. اغلب سویه‌های این باکتری متحرک و دارای تاژک می‌باشند (کوئین و همکاران. ۱۹۹۴ب).

۱-۱-۲-خصوصیات کشت

۱۴ (۴/۳۰%)

۳۲ (۶/۶۹%)

۴۶ (۱۰۰%)

نمودار ۳-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۲ در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه
از نظر حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایه‌های مورد آزمایش در این مطالعه، نتایج به این صورت بود که: از ۳۸ نمونه مرحله اول، تنها ۱ نمونه (۶/۲%) مثبت و ۳۷ نمونه (۴/۹۷%) منفی شد. از ۵۵ جدایه‌ مرحله دوم، ۷ جدایه (۷/۱۲%) مثبت و ۴۸ جدایه (۳/۸۷%) منفی شد. و از ۴۶ نمونه مرحله سوم، ۴ نمونه (۷/۸%) مثبت و ۴۲ جدایه (۳/۹۱%) منفی شد (جدول ۴-۴ و
نمودار ۴-۴).
فراوانی حضورهمزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ بین زمان های مختلف پرورش در جدایه های مورد مطالعه، اختلاف آماری معنی داری نشان ندادند (P > 0.05).
جدول ۴-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایه های E. coli جدا شده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی

مراحل نمونه گیری

تعداد (%) موارد مثبت

تعداد (%) موارد منفی*

تعداد (%) کل

مرحله اول

۱ (۶/۲%)

۳۷ (۴/۹۷%)

۳۸ (۱۰۰%)

مرحله دوم

۷ (۷/۱۲%)

۴۸ (۳/۸۷%)

۵۵ (۱۰۰%)

مرحله سوم

۴ (۷/۸%)

۴۲ (۳/۹۱%)

(۱۰۰%)

* مواردی که فقط برای یکی از اینتگرازها مثبت بوده را نیز شامل می‌شود

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

نمودار ۴-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه
به طور کلی از تمام ۱۳۹ جدایه بدست آمده از مراحل مختلف ۹۴ نمونه (۶/۶۷%) اینتگراز ۱ مثبت (۴۵ نمونه (۴/۳۲%) منفی) و ۲۹ نمونه (۹/۲۰%) اینتگراز ۲ مثبت (۱۱۰ نمونه (۱/۷۹%) منفی) و ۱۲ نمونه (۶/۸%) از نظر حضور همزمان هر دو اینتگراز مثبت (۱۲۷ نمونه (۴/۹۱%) منفی) بودند (جدول ۵-۴ و نمودار ۵-۴). محصولات PCR حاصل از موارد مثبت ژن‌های اینتگراز ۱ و ۲ به همراه نمونه‌های کنترل مثبت آن ژن‌ها پس از انجام الکتروفورز در ژل آگارز در مقایسه با مارکر ۱۰۰ جفت بازی در تصویر­ ۱-۴ نمایش داده شده است.
جدول ۵-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه

ژن مورد بررسی

تعداد (%) موارد مثبت

تعداد (%) موارد منفی

مجموع (%)

ترانسفورماسیون به معنای جذب DNA آزاد از سلولهای باکتری لیز شده در محیط مجاور آن می‌باشد. هنگامی که عوامل تعیین کننده مقاومت با این مکانیسم گرفته شد آنها می‌توانند بوسیله‌ی نوترکیبی هومولوگ وارد کروموزوم باکتریایی شوند که منجر به آرایش موزاییکی جدید ژن‌ها می شود.
ترانسداکسیون، انتقال DNA باکتریایی با واسطه باکتریوفاژ است و معمولا برای انتشار موثر و کارآمد ژن مقاومت چندان مهم و مطرح نمی‌باشد. فاژهایی که وارد کروموزوم باکتریایی شده‌اند، زمان خروج و بسته‌بندی در کپسول می‌توانند یک بخش از DNAباکتری راکه در مجاور آنها بوده است، با خود حمل کرده و متعاقب آن به سلول باکتری بعدی که توسط ویروس (فاژ) آلوده شده، منتقل می شود. کپسول همچنین می تواند شامل DNA نامربوط مانند پلاسمیدها کوچک و یا تکه های DNA باشد و سبب گسترش بیشتر آنها شود، این سناریویی است که برای فاژهایی که وارد DNA باکتری میزبان نشده‌اند صادق ‌می‌باشد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

کنژوگاسیون مهم ترین مکانیسم برای انتقال افقی محسوب می‌شود، که تبادل DNA زمانی رخ می‌دهد که سلول های دهنده و گیرنده در تماس مستقیم با یکدیگر باشند (رایس و بونومو، ۲۰۰۵).
تصویر ۲-۱ سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند. A) ترانسداکسیون B) ترانسفورماسیون C) کنژوگاسیون (لیامتانگ، ۲۰۰۸)

۹-۲-۲- عناصر دخیل در انتقال افقی ژن های مقاومت

پلاسمیدها، ترانسپوزونها، اینتگرون‌ها / کاست‌های ژنی، و جزایر ژنومی کروموزومی، نقش مهمی در انتقال افقی ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی بازی می‌کنند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱). این چهار نوع عنصر از DNA دو رشته تشکیل شده‌اند اما بطورواضحی در اندازه، ساختار، خواص بیولوژیکی و همچنین مکانیسم های گسترش، تفاوت دارند (شوارتز و همکاران، ۲۰۰۶)

۱-۹-۲-۲- پلاسمید‌ها

ناقل رایج برای انتقال ژنهای مقاومت است، پلاسمید‌ها خارج کروموزومی، و غالبا مولکولهای DNA حلقوی هستند. پلاسمیدها حاوی ژن های هستند که برای بقای باکتری ضروری نیست، اما اغلب برای باکتری ها مفید است برای مثال حاوی ژنهای مقاومت و ژنهایی که عملکرد متابولیکی و عوامل حدت را رمزگردانی می‌کنند، هستند. این عناصر مکانیسم های تکثیر خود را حمل می‌کنند و بنابراین می توانند به تعداد زیاد در سلول باکتری وجود داشته باشند. پلاسمیدهای کوچک، با اندازه‌‌ی حدود ۳ کیلوباز شناخته شده‌اند که در بیش از ۲۰ نسخه در یک سلول وجود دارند و در نتیجه در سویه باکتریایی میزبان بسیار پایدار هستند. از سوی دیگر پلاسمیدهای بزرگ که اندازه‌ای تا ۱۸۰ کیلو باز دارند، غالبا تنها در یک نسخه وجود دارند اما اغلب حامل ژنهای خاص برای پارتیشن بندی خود در سلولهای در حال تقسیم هستند تا اطمینان حاصل شود که هر سلول جدید یک کپی از پلاسمید را دارد. باکتری ها گاهی اوقات چندین پلاسمید مختلف حمل می‌کنند که می تواند شامل ژنهای مقاومت های مختلف بسیاری باشد. همه انواع پلاسمیدها نمی‌توانند در یک سلول باکتریایی همزیستی داشته باشند، این امر سبب تقسیم پلاسمیدها به گروه های ناسازگار می‌شود. مکانیسم اصلی انتقال پلاسمیدها کونژوگاسیون است. حداقل ۳۳ کیلوباز برای انتقال ژنها بواسطه‌ی کونژوگاسیون نیاز است. محدوده‌ی پلاسمیدهای گوناگون میزبان متنوع و بی‌ثبات است، در حالی که برخی فقط دریک گونه انتشار می‌یابند بقیه می‌توانند به طیف گسترده ای از میزبان ها منتقل شده و در نتیجه فاکتورهای مقاومت را بین گونه های مختلف مهم، گسترش دهند (رایس و همکاران، ۲۰۰۳؛ رایس و بونومو، ۲۰۰۵)

۲-۹-۲-۲- ترانسپوزونها

علاوه بر فاکتور‌های مقاومت یا‌ ژنهای دیگر، ترانسپوزونها عناصری هستند که ژنهایی را حمل می‌کنند که سبب جابجایی^[۲۸] خودشان، مستقل از نوترکیبی میزبان، می‌شود. ورود ترانسپوزونها گاهی اوقات، مثلا در مورد Tn7، خاص یک جایگاه^[۲۹] است اما غالبا در طیف گسترده ای از زمینه ها، هم در پلاسمید و هم درDNA کروموزومی وارد می‌شوند. از آنجا که ترانسپوزونها سیستم های تکثیر ندارند، آنها باید با کروموزوم یا پلاسمیدها ادغام شوند تا ثبات خود را حفظ کنند. ترانسپوزونها می‌توانند در ساختارها و اندازه های مختلف از کمتر از ۱ کیلوباز تا ۶۰ کیلوباز متفاوت باشند. کوچکترین نوع آنها توالی ورود^[۳۰] (IS) است که معمولا فقط حامل ژنهای ترانسپوزاز^[۳۱] است که محصولاتشان واسطه‌ی جابجایی عناصر ژنتیکی هستند. ورود ژنهای اضافی، مانند ژنهای سم، و غالبا ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی، ترانسپوزون‌ها را بزرگتر می‌کند (کیز و همکاران، ۲۰۰۸). ترانسپوزونهای مرکب^[۳۲]، مانند Tn9، Tn10، و Tn5706، معمولاحاوی یک یا چند ژن مرکزی مقاومت آنتی بیوتیکی و توالی ورود (IS) در دو انتهای خود هستند. ترانسپوزونهای پیچیده، مانند Tn1721، معمولا توسط توالی های تکراری معکوس انتهایی^[۳۳] و نیز گاهی اوقات توالی های تکراری داخلی مشخص می‌شوند که سبب جدا کردن بخش حامل ژنهای مقاومت از قسمت حامل ژنهای ترانسپوزاز می‌شود. همانند پلاسمید‌ها، ترانسپوزونهای کونژوگاتیو و غیرکونژوگاتیو نیز وجود دارند. ترانسپوزونهای کونژوگاتیو به عنوان مثال، Tn916 ، نه تنها در میان گونه‌های باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، بلکه بین هر دو گروه منتقل می‌شود. ژن مقاومت به تتراسیکلین، (tetM)، روی یک ترانسپوزون کونژوگاتیو واقع شده و می تواند در میان چندین جنس از باکتری ها مانند: گونه‌های انتروکوکوس، استافیلوکوکوس، استرپتوکوکوس، اکتینومایسس، بیفیدوباکتریوم، کمپیلوباکتر، قارچ Fusarium nucleatum، گونه های هموفیلوس و نایسریا انتقال یابد (سال‌یرز و شومیکر، ۲۰۰۶)

۳-۹-۲-۲- اینتگرون‌ها

۱۰-۲- ساختار و ویژگی‌های اینتگرون‌ها

اینتگرون‌ها عناصر ژنتیکی هستند که یک ابزار کارآمد برای گرفتن، بیان و تبادل ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری های گرم منفی را فراهم می‌کنند. اجزای ضروری یک اینتگرون شامل: ژن intI، که یک آنزیم ریکامبیناز با جایگاه خاص شناسایی را رمزگردانی می‌کند و یک سایت نوترکیبی attI، هستند. این سایت نوترکیبی توسط اینتگراز تشخیص داده می‌شود و یک سایت پذیرنده برای کاست‌های ژنی دریافتی است. علاوه بر این، یک پروموتور، Pc، سبب رونویسی از کاست‌های ژنی وارد شده می‌شود (تصویر ۳-۱). کاست های ژنی شامل یک چارچوب خواندن باز (ORF^[34]) برای ژنی که مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می‌کند و همچنین یک سایت نوترکیبی که عنصر ۵۹-بازی
(۵۹- be)^[35] نامگذاری شده، می‌باشند. این عناصر ۵۹ بازی، توالی‌های تکراری معکوسی هستند که در انتهای ’۳ چارچوب خواندن باز، یافت می‌شوند وتوسط اینتگراز تشخیص داده می‌شوند (مک، ۲۰۰۹)

تصویر۳-۱) ساختمان کلی یک اینتگرون (مک، ۲۰۰۹)
دوگروه عمده از اینتگرونها وجود دارند : انواع کروموزومی Chromosomal integrons (CIs )وانواع متحرک Mobile integrons (MIs ). CIs بر روی کروموزوم صدها گونه از باکتری هاوجود دارند. در طی تحقیقی نشان داده شدکه۱۷ % ژنوم باکتری های تعیین توالی شده آرایش ژنتیکی CIs را نشان داده اند (کمبری وهمکاران، ۲۰۱۰). CIs . اغلب درباکتری های اکوسیستم های دریایی وخاکی مثل گونه های گزانتوموناس و ویبریو شناسایی شده اند. نام دیگر اینتگرونهای کروموزومی super integrons (SIs )می باشد زیرا آنها می توانند تا ۲۰۰ کاست ژنی راحمل کنند که عملکرد محصول پروتئینی اغلب آنها ناشناخته است (ناس و همکاران، ۲۰۰۱).
کاست های ژنی که تا امروز در MIs شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند بنابراین به این اینتگرونها resistance integrons (RIs )یاmultidrug resistance integrons (MRIs )گویند (استالدر و همکاران، ۲۰۱۲).
تا کنون کلاسهای متنوعی از اینتگرون‌ها (MIs) شناسایی شده که سه گروه مجزا از آنها در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی درگیر هستند، که شامل کلاس۱، کلاس۲، و کلاس۳ می‌باشند. کلاس‌های گوناگون اینتگرونها بواسطه‌ی توالی ژن intI، که آنزیم اینتگراز را رمزگردانی می‌کند از هم تمایز داده می‌شوند.

۱-۱۰-۲- کلاس ۱ اینتگرون‌ها

کلاس ۱ اینتگرون‌ها برای اولین بار توسط استوکس و هال در سال ۱۹۸۹ شرح داده شد (استوکس و هال، ۱۹۸۴). آنها هنوز هم شایع‌ترین و گسترده‌ترین طبقه که مورد مطالعه قرار گرفته باقی مانده‌اند. اکثریت شناخته شده‌ی کاست‌های ژنی مربوط به مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها، که تا کنون شرح داده شده متعلق به کلاس ۱ اینتگرون‌هاست، که خصوصیت ویژه‌ی آنها حضور قسمت ثابت انتهایی ۵’ (۵’-CS) است. همانطور که قبلا اشاره شد ۵’-CS متشکل از سه مولفه اساسی از اینتگرون کلاس۱ است که که عبارتند از ژن intI1، یک سایت اتصال attI1 و پروموتور Pc (تصویر۴-۱)

تصویر۴-۱: ساختمان کلی کلاس۱ اینتگرون‌ها (مک، ۲۰۰۹)
ویژگی دیگر اکثر اینتگرون‌های کلاس۱ وجود بخش ثابت انتهای۳’ (۳’-CS) است. ۳’-CS به طور معمول ۲۳۸۴ جفت باز طول دارد و چهار ژن رمز گردان (ORFs) را کد می‌کند (براون و همکاران، ۱۹۹۶). اولین ژن رمزگردان ژن qacE∆۱است که نشان دهنده نسخه‌ی کوتاه شده کاست ژنی qacE است که مقاومت در برابر ترکیبات چهارتایی آمونیوم را کد می‌کند (تصویر۴-۱). این کوتاه شدگی ممکن است به علت قرار گرفتن فاکتور مقاومت سولفونامیدی sul1 در انتهای ۳’ آن باشد که منجر به از بین بردن عنصر ۵۹-بازی (۵۹- be) ژن qacE و برخی از توالی‌های رمزگردان آن شده است (پالسن و همکاران، ۱۹۹۳). سومین ژن رمزگردان، ORF5 است که هیچ عملکرد شناخته شده‌ای ندارد اما برخی شباهت‌ها به پورومایسین استیل ترانسفراز^[۳۶] نشان می‌دهد (تصویر۴-۱) (بیسونت و روی، ۱۹۹۲).چهارمین و آخرین ژن رمزگردان، ژن ORF6 است که هیچ عملکرد بیولوژیکی شناخته شده‌ای ندارد (تصویر۴-۱). انواعی از اینتگرون‌های کلاس۱ یافت شده‌اند که فاقد انتهای ثابت ۳’ هستند، یکی از این نمونه‌ها اینتگرون کلاس۱ است که در ترانسپوزون Tn402 یافت شده است که حاوی کاست کامل ژن qacE است، اما فاقد ژن sul1 و دو ژن رمز گردان دیگر می‌باشد (تصویر۵-۱) (راداشتروم و همکاران، ۱۹۹۴؛ هولودای و همکاران، ۱۹۹۵). این ترانسپوزون همچنین شامل یک واحد ژن جابجایی^[۳۷] (tni module) که حاوی ژن‌های tniA, tniB، tniQ و tniR (که به عنوان tniC شناخته می شود) است، می‌باشد (هولودای و همکاران، ۱۹۹۵)
همچنین این ترانسپوزون حاوی توالی‌های تکرار شونده معکوس^[۳۸] (IRs) است که در طرفین اینتگرون و واحدهای جابجایی قرار دارد (تصویر۵-۱). بنابراین، اینتگرون کلاس۱ که در داخل Tn402 قرار دارد، می‌تواند از طریق مکانیسم transposition به صورت افقی منتقل شود. اینطور فرض شده است که Tn402 جد امروزی اینتگرون‌های کلاس۱ می‌باشد (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۱الف؛ پارتریج و همکاران، ۲۰۰۱ب).

تصویر ۵-۱: ساختار کلاس ۱ اینتگرون‌ یافت شده در Tn402 (مک، ۲۰۰۹)
۲-۱۰-۲- کلاس ۲ اینتگرون‌ها
گروه دوم از اینتگرون‌ها نیز درون ترانسپوزونها (مثلا Tn7و ترانسپوزونهای مربوطه) یافت شده‌اند (تصویر۶-۱) (تیتز و همکاران، ۱۹۸۷؛ یانگ و همکاران، ۱۹۹۴؛ هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). تفاوت اساسی و ویژگی کلیدی توصیف کننده کلاس۲ اینتگرونها این است که ژن intI2 توسط یک کدون پایان ابتدایی متوقف می‌شود که منجر به تولید پروتئین غیر فعال ۱۷۸ اسید آمینه‌ای می‌شود. با این حال، جهش این کدون پایان منجر به بازیابی فعالیت اینتگراز می‌شود (هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). برای مثال اخیرا یک اینتگراز کلاس۲ فعال توسط مارکز و همکاران از سویه‌ای از ای‌کلای گزارش شد که با اینتگراز ۲ موجود در Tn7 شش نوکلئوتید تفاوت داشت که شامل کدون پایان هم بود و این اینتگرون شامل دو کاست ژنی برای مقاومت به تری متوپریم و لیپوپروتئین پپتیداز، بود.

تصویر۶-۱: ساختار اینتگرون کلاس۲ موجود در Tn7 (مک، ۲۰۰۹)
به طور کلی ۵ اینتگرون کلاس ۲ مشخص شده است. که هر پنج مورد حاوی، کاست‌های ژنی sat که مقاومت به استرپتوتریسین و aadA1 که مقاومت به استرپتومایسین و اسپکتینومایسین را رمزگردانی می‌کنند، هستند (تصویر۶-۱). اینتگرون مربوط بهTn7، همچنین حاوی کاست ژنی dfrA1 در مجاورت سایت attI2 می‌باشد که سبب مقاومت به تری‌متوپریم می‌شود. همچنین در این اینتگرون کاست ژنی چهارمی به نام orfX وجود داردکه یک پروتئین با عملکرد ناشناخته را رمزگردانی می‌کند. این ژن orfX فاقد عنصر ۵۹ بازی است اما از لحاظ عملکردی نقش سایت نوترکیبی دارد (هانسون و همکاران، ۱۹۹۷)
تفاوتهای مختصر در کاستهای ژنی اینتگرونهای کلاس۲ بیانگر میزانی از جابجایی کاستهای ژنی است که کاملا معلوم نیست به علت فعالیت نوترکیبی سایر اینتگرازها (کلاس ۱و۳) باشد یا به علت سرکوب گاه به گاه کدون پایان باشد که منجر به بازیابی فعالیت نوترکیبی اینتگراز۲ شده است (میزل، ۲۰۰۶).

۳-۱۰-۲- کلاس ۳ اینتگرون‌ها

اینتگرونهای کلاس ۳ دخیل در مقاومت آنتی‌بیوتیکی تنها در ژاپن و اخیرا در پرتقال و کانادا یافت شده‌اند. دو کاست ژنی در آرایه‌ی^[۳۹] ژنی این کلاس وجود دارد: bla_IMP-1، که متالو-بتاکلاکتاماز رارمزگردانی می‌کند و aacA4، که مقاومت به آمینوگلیکوزیدها را ایجاد می‌کند (تصویر۷-۱). کاست ژنی bla_IMP-1، سابقا در کلاس۱ شناسایی شده و به طور گسترده درآنها وجود دارد (میزل، ۲۰۰۶)

تصویر۷-۱: ساختار اولین اینتگرون کلاس ۳ از ژاپن (مک،۲۰۰۹)

۴-۱۰-۲- سوپر اینتگرون‌های کروموزومی یا کلاس ۴

سوپر اینتگرون‌ها برای اولین بار در ژنوم ویبریوکلرا (عامل وبا) توضیح داده شد. علت نامگذاری آنها آن است ساختار آنها ۱۲۶ کیلوباز طول دارد و حداقل ۱۷۸ کاست ژنی دارند (میزل و همکاران، ۱۹۹۸). اما این کاستهای ژنی به نظر نمی‌رسد هیچ مقاومت آنتی‌بیوتیکی را رمزگردانی کنند بلکه در اعمال تطبیقی از قبیل متابولیسم و تغییرات DNA شرکت می‌کنند گرچه هنوز مجموعه اعمال آنهابه طور کامل شناخته نشده است (میزل، ۲۰۰۶).
این کلاس واجد چندین ویژگی است: اولا باید ۲۰ کاست ژنی داشته باشد، ثانیا باید عناصر ۵۹-بازی انتهای ۳’ کاستهای ژنی بالغ بر ۸۰ درصد تشابه داشته باشند، ثالثا این کلاس نباید با هیج نوع عنصر ژنتیکی متحرک مرتبط باشد.

۱۱-۲-کاست ژنی

۱-۱۱-۲- تعریف

کاستهای ژنی ساختارهایی هستند که حاوی ژن رمزگردان مقاومت آنتی‌بیوتیکی و سایت نوترکیبی ۵۹-بازی هستند. این کاستها فاقد پروموتور هستند و بنابراین برای بیان باید وارد اینتگرونها شوند. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی در ارتباط با مقاومت آنتی‌بیوتیکی شناخته شده که سبب مقاومت تقریبا به تمام دسته‌ه ای آنتی‌بیوتیکی می‌شوند^[۴۰] (پالکی و همکاران، ۲۰۰۷). بیشتر کاستهای ژنی اینتگرونهای کلاس ۱و۲و۳ واسطه‌ی مقاومت به ترکیبات ضدمیکروبی هستند. که شاید یک دلیلش آن باشد که اکثر نمونه های مطالعه شده باکتریهای مقاوم، گرفته شده از موارد بالینی یامحیط بوده‌اند.
کاستهای ژنی به دو شکل یافت می‌شوند:
فرم حلقوی، آزاد یا غیر تکثیر شونده
فرم خطی، وقتی که وارد پلاسمید، ترانسپوزون یا کروموزوم می‌شود (تصویر۸-۱)

تصویر۸-۱: ساختار کاستها (B) ، همراه اینتگرون (رکیا و هال، ۱۹۹۵الف؛ پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹)
طول کاستهای ژنی معمولا بدلیل تفاوت در طول ناحیه‌ی رمزگردان و نیز سایت نوترکیبی ۵۹-بازی، متفاوت است (رکیا و هال، ۱۹۹۵الف). علیرغم اختلاف طول کاستهای ژنی یکسری ویژگیهای مشترک دارند که در ذیل به آنها اشاره شده است. مرزهای کاستها توسط دو توالی به نامهای Core site (CS) و Inverse core site (ICS) مشخص شده‌اند. این توالی‌های معکوس متعلق به سایت نوترکیبی ۵۹-بازی یا همان attC می‌باشد. حضور این توالی‌ها اولین بار در ژن aadB (کدکننده مقاومت به جنتامایسین) که وارد پلاسمید مقاومت چندگانه دارویی (MDR) pGDO100 شده بود، تشخیص داده شد (کامرون و همکاران، ۱۹۸۶). در مطالعه‌ای که استوکس و همکاران در سال ۱۹۸۹ در آن تمام کاستهای شناخته شده تا آن زمان را بررسی کردند مشخص شد که توالی ثابت GTTRRRY همواره در محل اتصال۵’-CS کاست ژنی به۳’-CS اینتگرون وجود دارد. بنابراین اینطور نتیجه‌گیری شد که کاست ژنی توالی TTRRRY را از کاست ماقبل خود و تنها G را از Core site خود گرفته است (تصویر۸-۱) (استوکس و هال، ۱۹۸۹).

تصویر۸-۱:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون (R نشان دهنده‌ی بازهای پورین وY