جدول 3-2، برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن XRCC4 . 21

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

جدول 3-3، باندهای حاصل از PCR در ژنوتیپ های XRCC4 22
جدول 3-4، برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن آنژیوتنسین 22
جدول 3-5، باندهای حاصل از PCR، ژنوتیپ های آنژیوتنسین 23
جدول 4-1، بررسی عوامل خطر کیفی دخیل در اسکیزوفرنیا 24
جدول 4-2، فراوانی های ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژنتیکی I/D ژن XRCC4
در دو گروه شاهدو بیمار 28
جدول 4-3، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی و آللی چند شکلی I/D ژن XRCC4
بین دو گروه شاهد و بیمار 29
جدول 4-4، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی I/D ژن XRCC4 ،
پس از تعدیل سیگار به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 29
جدول 4-5، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی I/D ژن XRCC4 ،
پس از تعدیل اثر سابقه بیماری در اقوام بیمار، به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 30
جدول 4-6، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی I/D ژن XRCC4 ،
پس از تعدیل ازدواج خویشاوندیوالدین بیمار، به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 30
جدول 4-7، فراوانی های ژنوتیپی و آللی چندشکلی ژنتیکی I/D ژن آنژیوتنسین
در دو گروه شاهد و بیمار 31
عنوان صفحه
جدول 4-8، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی و آللی چند شکلی I/D ژن آنژیوتنسین،
بین دو گروه شاهد و بیمار 32
جدول 4-9، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی I/D ژن آنژیوتنسین، پس از
تعدیل سیگار به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 32
جدول 4-10، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی I/D ژن آنژیوتنسین، پس از
تعدیل اثر سابقه بیماری در اقوام بیمار، به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 33
جدول 4-11، مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی I/D ژن آنژیوتنسین،
پس از تعدیل ازدواج خویشاوندی والدین بیمار، به عنوان عامل خطر اسکیزوفرنیا 33
جدول 5-1، مقایسه فراوانی های آللی و ژنوتیپی ژن ACE در جمعیت های ایران،
شمال هند، ترکیه، ایتالیا 39
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 3-1- نتایج حاصل از PCR-RFLP بر روی ژل برای ژن XRCC4 24
شکل 3-2- نتایج حاصل از PCR-RFLP بر روی ژل برای ژن ACE 24
فصل اول
مقدمه
1-1- اسکیزوفرنیا
اسکیزوفرنیا (روان گسیختگی) سندرومی بالینی شامل آسیب های روانی متغیر اما عمیقاً ویرانگری است که شناخت، هیجان^[1]، ادراک و سایر جنبه های رفتار را درگیر می کند. بروز این تظاهر در افراد مختلف و در طول زمان متغیر است اما تأثیر بیماری همواره شدید و معمولا دیرپا^[2] است. اسکیزوفرنیا معمولاً قبل از 25 سالگی شروع می شود و تا آخر عمر پایدار می ماند و هیچ یک از طبقات اجتماعی از ابتلای به آن مصون نیستند. بلویلر^[3] اصطلاح اسکیزوفرنیا را وضع کرده است تا مبیّن گسیختگی^[4]هایی باشد که میان فکر، احساس، و رفتار بیماران مبتلا به این اختلال وجود دارد (کاپلان، 1378).
یک درصد جمعیت جهان، به اختلال اسکیزوفرنی دچار هستند و معمولا گزارش می شود که به طور مساوی بر جنس زن و مرد تاثیر گذار است (هر چند بحث در مورد خطر بیشتر برای مردان وجود دارد (Aleman et al., 2003).
میزان بروز سالیانه اسکیزوفرنی از 5/0 تا 5 در صد در هر 10000 نفر متغیر است و این میزان در نواحی جغرافیایی مختلف نیز یکسان نیست. مثلاً، میزان بروز اسکیزوفرنی در افرادی که در نواحی شهری جوامع صنعتی به دنیا آمده اند بیشتر است (کاپلان، 1378).
1-1-2- علائم اسکیزوفرنیا
– نشانه های مثبت^[5]: رفتارهای عجیبی هستندکه به رفتارهای عادی فرد بیمار افزوده می شوند و شامل هذیان ها^[6]، تفکر و گفتار از هم گسیخته، توهم^[7] و رفتارهای عجیب و غریب^[8]می باشند.
انواع هذیان:
هذیان گزند و آسیب^[9]: فرد مبتلا تصور می کند دیگران می خواهند به او آسیب برسانند.
هذیان عظمت (بزرگ منشی)^[10]: به عنوان مثال فرد مبتلاء تصور می کند ناپلئون است.
هذیان کنترل: فرد مبتلاء تصور می کند دیگران افکار او را کنترل می کنند.
هذیان تنی (بدنی، جسمی)^[11]: فرد تصور می کند فکر و ذهنش پاره می شود.
توهم: در بیماران مبتلا به اسکیزوفرنی، هر یک از پنج حس ممکن است دچار حالات توهمی گردد. اما شایع ترین توهم ها، توهم های شنوایی است. این صداها اغلب به تهدید، اهانت، اتهام یا فحاشی می پردازند. ممکن است دو یا چند صدا باشند که با هم به گفتگو می پردازند و یا یک صدا باشد که در مورد زندگی یا رفتار بیمار اظهار نظر می کند. توهم های بینایی هم شایع است، اما توهمهای لمسی، بویایی و چشایی معمول نیست.

در نرم­افزار SPSS.19 شاخصی بعنوان (P-Value) جهت بررسی آزمون ارائه می­ شود، چنانچه این مقدار از سطح خطا کمتر باشد فرض H₀ رد می­ شود و گرنه دلیلی بر رد این فرض وجود ندارد. در صورتی که فرض H₀ رد شود با بهره گرفتن از آزمون­های تکمیلی به بررسی دوبه­دوی مؤلفه­ ها پرداخته می‌شود. نهایتاً متغیری که رتبه بالاتری داشته باشد تأثیرگذاری بیشتری بر رضایت شغلی خواهد داشت.
۳-۹-۲-۲) ضریب همبستگی
در بسیاری از پدیده‌های طبیعی می‌توان نوعی رابطه یا همبستگی بین متغیرها تصور نمود. تحلیل همبستگی ابزاری است آماری که به وسیله آن می­توان نوع رابطه و درجه­ای را که یک متغیر به متغیر دیگر از نظر خطی مرتبط است، اندازه ­گیری کرد. ضریب همبستگی یکی از معیارها مورد استفاده در تحلیل همبستگی دو متغیر می­باشد (مومنی و قیومی،۱۳۸۹: ص۱۱۱).
برای آزمون فرضیات تحقیق، از ضریب همبستگی استفاده شده است و چون فرضیه‌ها جهت‌دار است، آزمون همبستگی، آزمون یک دامنه خواهد بود. ضریب همبستگی اسپیرمن، برای بررسی ارتباط خطی بین متغیرهای کمی مورد مطالعه در یک پژوهش به‌کار می‌رود. این آزمون در جایی بکار می­رود که بخواهیم به بررسی وجود یا عدم وجود رابطه و سنجش میزان شدت رابطه بین متغیرها بپردازیم.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

اندازه‌ی همبستگی بین متغیر‌ها ضریب همبستگی نامیده می‌شود، که معمولاً از صفر تا ۱+ و از صفر تا ۱- تغییر می‌کند. ضریب همبستگی ۱+ را همبستگی مثبت کامل و ضریب همبستگی ۱- را همبستگی منفی کامل می‌نامند و ضریب همبستگی صفر نشانگر آن است که بین دو متغیر هیچ نوع همبستگی وجود ندارد. در این پژوهش از ضریب همبستگی اسپیرمن برای تحلیل همبستگی متغیرهای استفاده شد.

R_i

رتبه‌های متناظر مقادیر داده‌ها

S_i

رتبه‌های متناظر مقادیر داده‌ها

n

تعداد مشاهدات

۳-۹-۲-۳) رگرسیون گام به گام^[۱۳۲]
در استفاده از همبستگی به منظور بررسی رابطه متغیرها، ممکن است ارتباط بدست آمده بین اخلاق حرفه­ای و رضایت شغلی تحت تاثیر همبستگی بین ابعاد اخلاق حرفه­ای باشد، به منظور حذف همبستگی و از بین بردن اثر متغیرها بر هم، پژوهشگر در این تحقیق از رگرسیون گام به گام استفاده می­نماید تا ضریب اثر را نیز به نوعی مشخص سازد.
فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ­ها
۴-۱) مقدمه:
یکی از مراحل روش علمی تحقیق، تجزیه و تحلیل اطلاعات بدست آمده است. در هر تحقیق، تجزیه و تحلیل اطلاعات برای بررسی صحت و سقم فرضیات از اهمیت خاصی برخوردار است و از اصلی­ترین و مهم­ترین بخش­های تحقیق محسوب می­ شود. تجزیه و تحلیل داده ­ها فرآیندی است که طی آن داده­هایی که از طریق به کارگیری ابزارهای جمع­آوری از نمونه آماری فراهم آمده­اند، کدبندی، طبقه ­بندی و در نهایت پردازش می­شوند. به منظور تجزیه و تحلیل داده ­های جمع­آوری شده از آمار توصیفی و استنباطی استفاده گردید.
– آمار توصیفی شامل طبقه ­بندی، خلاصه کردن و نمایش داده ­های آماری است، بدن آنکه استنباطی از آنها صورت پذیرد. بنابراین، در آمار توصیفی متغیرهای جمعیت­شناختی تحقیق شامل سن، جنسیت، وضعیت تاهل، مدرک تحصیلی و سنوات خدمت از نرم­افزار SPSS استفاده شد.
– در آمار استنباطی نیز داده ­ها جهت انجام آزمون فرضیات در نرم­افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار می­گیرند.
مطالب این بخش، در دو قسمت ارائه می­گردد، در قسمت آمار استنباطی به منظور بررسی فرضیه ­های تحقیق از آزمون ضریب همبستگی و در قسمت یافته­های جانبی از آزمون­های فریدمن و آنالیز واریانس یک طرفه استفاده می‌شود.
۴-۲) تجزیه و تحلیل توصیفی داده ­ها:
در این بخش با بهره گرفتن از جداول و نمودارها، به تجزیه و تحلیل توصیفی داده ­ها پرداخته و ویژگی­های جمعیت شناختی نمونه مورد مطالعه و متغیرهای تحقیق را مورد بررسی قرار می­دهیم.
۴-۲-۱) آمار توصیفی متغیرهای جمعیت­شناسی:
معمولاً برای شناخت نمونه آماری (پاسخ دهندگان تحقیق)، متغیرهای جمعیت شناختی با بهره گرفتن از بخش دوم پرسشنامه مورد بررسی قرار می­گیرند. لذا در این بخش، به بررسی توزیع نمونه آماری (فراوانی، درصد فراوانی) از حیث متغیرهائی چون سن، جنسیت، وضعیت تاهل، مدرک تحصیلی و سنوات خدمت پرداخته می‌شود. بنابراین اطلاعات بدست آمده در مورد ویژگی­های جمعیت­شناختی نمونه­ آماری به شرح ذیل است؛
۴-۲-۱-۱) توزیع فراوانی نمونه از نظر جنسیت:
جدول شماره (۴-۱) توزیع نمونه آماری مدیران نواحی چهارگانه شهرداری استان قم را از نظر جنسیت نشان می­دهد. بر این اساس نمونه آماری متشکل از ۵۲ نفر (۱۰۰%) مرد می­باشند.
جدول شماره (۴-۱) توزیع فراوانی نمونه از نظر جنسیت

جنسیت

فراوانی

درصد فراوانی

شکل ۴-۱۱- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85

۵۴

شکل ۴-۱۲- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF₆

۵۵

شکل ۴-۱۳- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C₄MIM][PF₆]

۵۵

فصل اول
مقدمه
۱-۱- آنزیم­ها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که می­توانند سرعت واکنش­ها را تا ۱۷ برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده^[۱] زمین لیپیدها هستند و آنزیم­ های لیپولیتیک^[۲] نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیم­ های لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلول­های یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیم­ها مزایای زیادی در انجام واکنش­ها دارند که از جمله آن­ها می­توان اختصاصیت بالای آن­ها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینه­ها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیم­ها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان ۱%- ۱/۰% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم در^[۳]BOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

آنزیم­ های میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیم­ های میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دست­ورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن می­باشد)، پایداری بیش­تر و تولید آسان­تر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتری­ ها و بنابراین آسان­تر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آن­ها، باعث تسهیل فرآیندهایی هم­چون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دست­یابی به بیش­ترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلول­ها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی می­شوند. تنها حدود دو درصد از گونه­ های میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شده ­اند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیش­تر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفته­اند (Frost and Moss, 1987).
۱-۲- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال ۱۹۰۱ در باکتری­ های Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نام­های امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتری­ های گفته شده هم­اکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص داده­اند. حدود ۳۰۰ سال از آغاز مطالعات روی آنزیم­ های هیدرولیز کننده تری­گلیسریدها می­گذرد و حدود ۷۰ سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنش­های هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال ۱۸۵۶، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسان­ها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیم­ های پانکراس می­گرفتند و از آن به عنوان کمک هضم­کننده غذا استفاده می­نمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمع­آوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیم­ها دارای توانایی کاتالیز واکنش­های مختلفی از جمله واکنش­های هیدرولیزی^[۴]، یا سنتز کربوکسیلیک­استر^[۵]های مختلف و تبدیل آن­ها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیم­ های لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهم­ترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژن­های مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن می­باشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی می­توان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر^[۶]، بیودیزل^[۷]، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعم­دهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغن­ها و چربی­ها طی فرآیندهای شیمیایی را می­توان به کمک لیپازها با سرعت بیش­تر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهت­گزینی^[۸] بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آن­ها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونه­ های متعددی از باکتری­ ها، مخمرها و قارچ­های رشته­ای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول۱) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول ۱-۱- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز

منشأ

جنس

گونه

باکتری

Bacillus

B. megaterium

B. subtilis

B. thermoleovorans

B. thermocatenulatus

B. cereus

Pseudomonas

P. putida ۳SK

P. aeruginosa

۴۰۳/۰

۶/۹۱

۵/۲

دیالیز

۳۱/۱۲

۶۰۸/۴

۳۷۴/۰

۷/۸۱

۰/۳

ستون Q-سفاروز

۲۷۷/۰

۹۳۲/۰

۳۶۵/۳

۵/۱۶

۹/۲۶

شکل ۴-۴- تصویر SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL؛
۱) عصاره سلول قبل از القا، ۲) عصاره سلول ۶ ساعت بعد از القا، ۳) عصاره سلول ( پس از سونیکیت)،
۴) محتوای پروتئینی پس از رسوب دهی دمایی، ۵) آنزیم خالص پس از ستون Q- سفاروز، ۶) مارکر وزن ملکولی پروتئین
۴-۳- سنتز مایعات یونی
مایعات یونی [C₂MIM][Br]، [C₄MIM][Br]، [C₆MIM][Br]، [C₁₂MIM][Br]، [C₄MIM][PF₆]، [C₆MIM][PF₆] بر اساس روش گفته شده در بخش ۳-۳-۱، سنتز شدند. گرانروی این مایعات یونی با افزایش طول زنجیره افزایش می­یابد و مایع یونی [C₁₂MIM][Br] در دمای اتاق به صورت جامد است. مایعات یونی دارای آنیون PF₆^– به طور کلی گرانروی بیشتری نسبت به مایع یونی دارای آنیون Br^– دارند.
۴-۴- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
در این بخش با افزودن مایع یونی با غلظت­های نهایی مشخص در مخلوط واکنش اثر طول زنجیره آلکیلی کاتیون ([C_nMIM] n=2,4,6,12) و غلظت­های مایع یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز TTL مورد بررسی قرار گرفت. تمامی آزمایشات دو بار تکرار شدند و به دلیل نزدیک بودن نتایج به هم، از اعداد به دست آمده از دو تکرار میانگین گرفته شد. در مایعات یونی مورد بررسی، مایعات یونی با زنجیره­های کوتاه آلکیلی اثر مطلوب بیشتری بر فعالیت آنزیمی داشته اند و در زنجیره­های بلند کربنی کاهش فعالیت را می­توان دید.
همان­طور که در نمودار نشان داده شده است(شکل ۴-۵)، با افزایش غلظت مایعات یونی در ابتدا افزایش فعالیت هیدرولازی TTL تا رسیدن به یک غلظت بهینه را می­توان دید و غلظت­های بالاتر از آن سبب کاهش فعالیت آنزیمی شده ­اند. هرچند در رابطه با مایع یونی [C₁₂MIM][Br] تنها اثر کاهشی بر فعالیت آنزیم دیده شد. بیشترین اثر افزایشی در فعالیت هیدرولازی TTL را می­توان به ترتیب در رابطه با مایعات یونی [C₄MIM][Br]، [C₂MIM][Br]، [C₆MIM][Br] دید. بیشترین فعالیت نسبی آن­ها به ترتیب ۲۵۴%، ۱۷۷% و ۱۳۵% بود که به ترتیب در غلظت­های ۱۰۰۰، ۳۰۰ و ۳۰۰ میلی مولار از مایع یونی به دست آمدند.
شکل ۴-۵- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی
۴-۵- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL
۴-۵-۱- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی
با توجه به نمودار پایداری دمایی (شکل ۴-۶) آنزیم TTL در محیط بافری در دمای ۷۵ درجه سانتیگراد پس از گذشت یک ساعت همچنان ۹۰ درصد از فعالیت خود را حفظ می­ کند. اما در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد آنزیم با گذشت زمان به مرور پایداری خود را از دست می­دهد. پس از گذشت یک ساعت حرارت­دهی در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد ۳۹ درصد از فعالیت باقی خواهد ماند. در دماهای بالاتر از ۸۰، دمای ۸۲ و °C 85، آنزیم کاملا ناپایدار بوده و پس از گذشت ۱۵ دقیقه از حرارت­دهی هیچ فعالیتی مشاهده نشد.
شکل ۴-۶- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 ، ۸≈pH.
۴-۵-۲- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی
۴-۵-۲-۱- بررسی پایداری TTL در [C₄MIM][Br] و ] [C₄MIM][PF₆ در دماهای مختلف
بررسی پایداری دمایی در مخلوط آبی [C₄MIM][Br] با غلظت ۱ مولار، در دمای °C 90 افت شدیدتری در پایداری آنزیم نسبت به دمای °C 85 را نشان می­دهد. همان­طور که در نمودار پایداری دمایی (شکل ۴-۷) می­توان دید، در دمای °C 85، در محیط [C₄MIM][Br]، بیش از ۹۰ درصد از فعالیت آنزیمی تا ۳۰ دقیقه حفظ شده است و بعد از گذشت یک ساعت از حرارت­دهی همچنان بیش از ۶۰ درصد از فعالیت آنزیمی باقی می­ماند. آنزیم TTL در محیط [C₄MIM][Br] در دمای °C 90، پس از گذشت ۱ ساعت، ۴۵ درصد از فعالیت خود را حفظ می­ کند. نتایج نشان می­دهد که پایداری دمایی آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] به شدت افزایش یافته است. آنزیم TTL در محیط [C₄MIM][PF₆] پس از ۴۵ دقیقه حرارت­دهی در دمای °C 85، همچنان ۹۶ درصد از پایداری خود را حفظ کرده است. با افزایش دما به °C 90 توانایی مایع یونی [C₄MIM][PF₆] در حفظ پایداری آنزیم به همان شدت قبل است. همان­طور که در نمودار B از شکل ۴-۷ مشاهده می­ شود، آنزیم TTL در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] پس از گذشت ۹۰ دقیقه حرارت­دهی در °C 90 و °C 85، هم­چنان ۷۲ درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ می­ کند.
شکل۴-۷- نمودار پایداری TTL در [C₄MIM][Br] و [C₄MIM][PF₆] در دماهای °C 85 و °C 90.
الف) محیط [C₄MIM][Br] ب) محیط [C₄MIM][PF₆].
۴-۵-۲-۲- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی
مایعات یونی ایمیدازولیومی بسته به نوع آنیونی که در ساختار خود دارند، شدت اثر پایدارکنندگی متفاوتی را از خود نشان می­ دهند. برای مثال در مقایسه­ ای بین مایعات یونی [C₄MIM][PF₆] و [C₄MIM][Br] در دماهای بالا (°C85 و °C90) اثر پایدارکننده بیشتری در مورد مایع یونی دارای آنیون ^–PF₆ می­توان دید (شکل۴-۸).در دمای °C85 ، ۹۶ درصد از آنزیم­ها در محیط [C₄MIM][PF₆] پس از ۴۵ دقیقه حرارت دهی پایدار مانده­اند و پس از آن شیب ملایمی از کاهش پایداری TTL مشاهده می­ شود و پس از ۹۰ دقیقه همچنان ۷۰ درصد از آنزیم­ها پایداری خود را حفظ کرده ­اند. در حالی­که پایداری آنزیم در محیط [C₄MIM][Br] طی حرارت­دهی در °C85، با سرعت بیشتری کاهش یافت و در پایان ۹۰ دقیقه حرارت­دهی، ۴۱ درصد از فعالیت اولیه آنزیمی مشاهده شد. با افزایش دما به °C 90 حفظ پایداری آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] با همان روند قبل دیده می­ شود، در حالی­که در محیط [C₄MIM][Br] روند کاهشی شدیدتری در پایداری آنزیم مشاهده می­ شود. پس از ۶۰ دقیقه حرارت­دهی در °C 90 پایداری به ۴۵ درصد میزان اولیه رسیده است و پس از ۹۰ دقیقه تنها ۳۲ درصد از آنزیم­ها پایدار مانده­اند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۴-۵-۲-۳- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم
پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول­های مختلف زنجیره کربنی مورد بررسی قرار گرفت. همان­طور که در شکل۴-۹ مشاهده می­ شود مایعات یونی با زنجیره­های ۲، ۴ و ۶ کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان می­ دهند. در این میان [C₆MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C₂MIM][Br] و [C₄MIM][Br]، محیط مناسب­تری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم می­ کند. در مورد این ۳ مایع یونی پس از گذشت ۱ ساعت دمادهی در °C85 بیش از ۵۰ درصد از فعالیت آنزیم همچنان باقی مانده است. همچنین مایعات یونی با زنجیره ۱۲ کربنه هیچ گونه اثر مطلوبی بر پایداری آنزیم نشان نداده است.
همان­طور که در شکل ۴-۱۰ نشان داده شده است، دو نوع مختلف کاتیون از پایه ایمیدازولیوم و پایه پیریدینیوم تفاوت چندانی در میزان پایداری آنزیم ایجاد نمی­کنند. اثر پایدارکننده مشابهی در مورد مایع یونی [C₅Py][Br] و مایعات یونی [C₄MIM][Br] و [C₆MIM][Br] دیده شد. در رابظه با مایع یونی [C₁₂Py][Br] نیز مانند [C₁₂MIM][Br] هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم مشاهده نشد.
شکل۴-۸- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون.

• A) دمای °C85 B) دمای °C90

شکل ۴-۹- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم
بر پایداری دمایی آنزیم
شکل ۴-۱۰- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL.
۴-۶- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی
در این بخش از پژوهش ابتدا پایداری ساختاری آنزیم در بافر تریس در دمای °C 85 مورد بررسی قرار گرفت. شکل ۴-۱۱ طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 (pH = 8) را در زمان­های مختلف حرارت­دهی در °C 85 (0، ۳۰ و ۶۰ دقیقه) نشان می­دهد. بیشینه نشر فلورسانس در مورد آنزیم TTL قبل از حرارت­دهی ۵۷۰ و در λ_Max ۳۳۳ نانومتر است. پس از حرارت­دهی شدت نشر فلورسانس به شدت کاهش یافته، به طوری که در زمان ۳۰ دقیقه بیشینه نشر به ۳۸۵ ودر زمان ۶۰ دقیقه به ۳۶۸ کاهش یافته است.

شکل ۴-۱۱- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85
به منظور بررسی پایداری دمایی ساختار آنزیم درمحیط مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون ^–PF₆ در غلظت ۱۰۰ % ، در دمای °C 85، به مدت ۱ ساعت انکوبه گردید. در مقایسه بین دو طول مختلف زنجیره آلکیلی کاتیون، مایع یونی [C₄MIM][PF₆] با شدت نشر فلورسانس بیش­تر نسبت به [C₆MIM][PF₆]، اثر پایدارکنندگی بیش­تری را از خود نشان داد. در شکل ۴- ۱۲ مشاهده می­ شود که شدت نشر فلورسانس پس از ۱ ساعت حرارت­دهی به آنزیم در دمای °C 85، در محیط [C₄MIM][PF₆] در سطح ۶۱۶ و در مورد [C₆MIM][PF₆] در سطح ۳۳۲ قرار گرفته است. همچنین کاهش λ_Max در محیط [C₆MIM][PF₆] به میزان nm 5 دیده شد.
با بررسی طیف فلورسانس مربوط به TTL تیمار شده در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] مقداری کاهش شدت نشر پس از ۳۰ و ۶۰ دقیقه دمادهی در °C85 می­توان دید (شکل ۴-۱۳). با این وجود تفاوت زیادی در نشر فلورسانس بین نمونه­های حرارت دیده در مایع یونی و نمونه آنزیم غیرفعال وجود دارد که این امر گویای حفظ درصد بالایی از ساختار آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] است.

۵/۵۶ میلی لیتر/کیلوگرم(دقیقه)

۴۰۰ متر

شکل ۳-۹ : آزمون بالک ۳-۱۰ : اجرای آزمون بالک (دقیقه ۱۰ آزمون)
۳-۸-۲- مرحله انتخاب آزمودنی ها
پس از مطالعه فرم های تکمیل شده توسط داوطلبین و با در نظر گرفتن معیارهای ورود به طرح و همچنین مشخصات جمع‌ آوری شده از جمله قد، وزن وحداکثر اکسیژن مصرفی وbmi (شاخص توده بدنی) ۲۱نفر از افراد واجد شرایط، انتخاب شده و به صورت تصادفی در دو گروه مکمل و پلاسبو جایگزین شده و کد‌گذاری شدند. آزمون گر و آزمودنی‌ها از این که در کدام گروه قرار گرفته بودند هیچ اطلاعی نداشتند و در‌واقع تحقیق به صورت دوسویه کور انجام شد. از افراد انتخاب شده درخواست شد که در طول مدت زمانی که از مکمل استفاده می‌کنند و قبل از اجرای آزمون اصلی از انجام هرگونه فعالیت بدنی خودداری کرده و دستورالعمل‌های خواسته شده در رابطه با تغذیه را اجرا نمایند. همچنین از آن‌ها خواسته شد شب قبل از اجرای پروتکل اصلی استراحت کافی داشته باشند.
۳-۸-۳- مرحله ارزیابی نهایی
پروتکل اصلی در مدت ۱۵ روز اجرا شد، بدین ترتیب که در طول مدت ۱۵ روز در زمان مشخصی هر دو گروه مکمل و پلاسبو به آزمایشگاه فیزیولوژی ورزشی دانشگاه آزاد مراجعه می کردند ( برای دریافت قرصهایی که به شکل کپسول و حاوی ۲ گرم ال-کارنیتین و۲ گرم نشاسته بودند و از نظر ظاهر تفاوتی با هم نداشتند) و در روز پانزدهم تست هوازی اصلی اجرا شد که مراحل مختلف خون گیری و تهیه سرم و پلاسما به شرح زیر است:

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

مرحله اول :
ابتدا آزمودنی ها قبل از شروع مکمل دهی و اجرای فعالیت هوازی با هماهنگی قبلی برای اولین خون گیری در آزمایشگاه حاضرشدند. آزمودنی ها به صورت ناشتا و به منظور طبیعی شدن تغییرات وضعیتی حجم خون به مدت ۱۵ دقیقه سر پا ایستادند و سپس در حالت نشسته و پس از بستن تورنیکه ۷ سی سی نمونه خونی از ورید جلوی آرنج^[۳۵] گرفته شد (خون گیری باراول).

شکل ۳-۱۲: آماده نمودن خون دریافتی برای سانتریفوژ
شکل ۳-۱۱: نحوه خون گیری از ورید
آنتیکوبیتال
مرحله دوم :
پس از خون گیری بار اول، آزمودنی ها به مدت ۱۴ روز۲ گرم ال-کارنیتین (در گروه مکمل) و ۲ گرم نشاسته (در گروه دارونما) که هیچ گونه تفاوتی از نظر رنگ و بو با هم نداشتند و به صورت کپسول تهیه شده بود مصرف کردند و سپس در روز پانزدهم قبل از اجرای تست استقامتی (دویدن مسافت ۱۴ کیلومتر) خون گیری به صورت ناشتا با همان ترتیب ذکر شده (۷ سی سی) توسط همکار طرح انجام شد، سپس آزمودنیها صبحانه یکسان مصرف کرده و بعد از دو و نیم ساعت تست هوازی اصلی را انجام دادند. لازم به ذکر است که در این زمان دمای هوا ۱۵ درجه سانتی گراد و رطوبت محیط ۹۶-۴۴% بود.
مرحله سوم :
در این مرحله آزمودنی ها بعد از حرکات کششی به مدت ۵ دقیقه، جهت اجرای پروتکل اصلی یک مسافت ۷ کیلومتری را با حداکثر ضربان قلب خود ۲ دوردویدند (۱۴ کیلومتر). و بلافاصله پس از اجرای تست استقامتی در همان محل، خون گیری برای بار سوم انجام گرفت.

شکل ۳-۱۳: مراحل اجرای پروتکل اصلی
(دویدن مسافت ۱۴ کیلومتر)
شکل ۳-۱۴: اتمام دور اول پروتکل اصلی
شکل ۳-۱۵: خون گیری بلافاصله بعد از دویدن ۱۴ کیلومتر
مرحله چهارم :
پس از گذشت ۲ ساعت از اجرای پروتکل اصلی (تست هوازی) خون گیری بار چهارم نیز به میزان ۷ سی سی و مراحل مختلف جداسازی سرم و پلاسمای خون به همان ترتیب ذکر شده، درمحل آزمایشگاه فیزیولوژی ورزشی دانشگاه آزاد، از آزمودنی ها به عمل آمد.
مرحله پنجم :
این مرحله از خون گیری پس از گذشت ۲۴ ساعت از اجرای پروتکل اصلی در محل آزمایشگاه فیزیولوژی ورزشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، از آزمودنی ها به عمل آمد. پس از انجام خون گیری، نمونه های سرم و پلاسمای هر آزمودنی در یخچال ۷۰- درجه سانتی گراد قرار گرفتند تا در زمان لازم جهت اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال و کراتین کیناز مورد استفاده واقع شود.
شکل ۳-۱۷: کدگذاری خونهای دریافتی
شکل ۳-۱۶: سانتریفوژ کردن خون های تهیه شده
روش تهیه سرم و پلاسما
از مجموع ۷ سی سی نمونه خونی دریافت شده از ورید آرنج آزمودنی ها، دوسی سی درون لوله آزمایش حاوی ماده ضد انعقاد هپارین به منظور جداسازی پلاسما، ریخته شد و پس از حرکت دادن آن به صورت دورانی جهت مخلوط شدن، بلافاصله درون سانتریفوژ قرار گرفت و به مدت ۱۰دقیقه با دور ۴۰۰۰ سانتریفوژ گردید. پلاسمای جدا شده در مقادیر مورد نیاز درون میکروتیوب هایی که از قبل کدگذاری شده بودند با استفاده ازسمپلر ریخته شده و بلافاصله درداخل یخچال با دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد. از این پلاسما جهت اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال استفاده گردید. پنج سی سی باقی مانده از خون، در لوله آزمایش معمولی (بدون ماده ضد انعقاد خون) ریخته شد تا بتوان از آن سرم جدا نمود. نمونه های خونی موجود در لوله آزمایش معمولی ابتدا درون دستگاه انکباتور قرار گرفتند تا در دمای نزدیک به دمای بدن (۳۷ درجه سانتی گراد) نگه داشته شوند. سپس به مدت ۵ دقیقه و با دور ۴۰۰۰ سانتریفوژ گردیدند تا سرم موجود در آن از سایر اجزا جدا گردد. این مقدار سرم جدا شده نیز در اندازه های مورد نیاز درون میکروتیوب های کدگذاری شده، ریخته شد و بلافاصله درجایخی فریزر با دمای ۲۰- درجه
سانتی گراد قرار داده شد تا برای اندازه گیری میزان کراتین کیناز، مالون دی آلدئید و بیلی روبین از آن استفاده گردد.
ثبت مواد غذایی :
همه آزمودنی ها دستور العمل های کتبی و توصیف شفاهی در مورد چگونگی ثبت مواد غذایی را دریافت کردند. از آن‌ها خواسته شد که رژیم غذایی عادی خود را دنبال کنند و در عین حال مقدار و نوع غذای مصرفی خود را روزانه به مدت دو هفته در فرم های مخصوصی ثبت کنند. این فرم ها در روز آخر از آزمودنی ها اخذ شد و سپس میزان کالری کل، پروتئین، کربوهیدرات، چربی، ویتامین C، ویتامین A و ویتامین E مواد غذایی مصرفی آزمودنی‌ها با بهره گرفتن از نرم افزار تحلیلی(Spss16) آنالیز گردید.
۳-۸-۴- روش اندازه گیری مالون دی آلدئید خون
برای اندازه گیری مالون دی آلدئید از روش تیوباربیتوریک اسید (TBARS) به صورت دستی و دستگاه اسپکتروفتومتری با طول موج ۵۳۲ نانومتر جهت جذب آن استفاده شد (در پیوست چهارمفصلاً توضیح داده شده است). نمونه مورد نظر برای اندازه گیری این متغیر سرم می باشد(۱۱۱).
۳-۸-۵- روش اندازه گیری کراتین کیناز
برای اندازه گیری کراتین کیناز از دستگاه اسپکترفتومتری با روش فتومتریک و طول موج ۳۴۰ استفاده گردید. نمونه مورد نظر برای اندازه گیری این متغیر سرم بدون همولیز یا پلاسمای هپارینه بود که روش تهیه و طرز محاسبه آن با بهره گرفتن از کیت تجاری تشخیص کمّی ساخت شرکت درمان کاو انجام شد.
۳-۸-۶ – روش اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال
ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال در این تحقیق، با روش FRAP^[36] به صورت دستی اندازه گیری شد (۱۳۱). این روش بر اساس احیای کمپلکس فریک تری پیریدیل تریازین ^[۳۷]( (Fe ۳-TPTZبه فروس تری پیریدیل تریازین^[۳۸](Fe 2-TPTZ) می باشد (۶۵). طول موج اسپکتروفتومتر۵۹۳ و با بهره گرفتن از بلانک حاوی آب مقطر، دستگاه بر روی صفرتنظیم گردید. نمونه مورد نظر برای اندازه گیری این متغیر پلاسما بود که جهت محاسبه آن تفاوت بین دو جذب نوری را به دست آورده و با بهره گرفتن از فرمول مربوط به منحنی کالیبراسیون میزان TAC به دست آمد.
۳-۸-۷- روش اندازه گیری بیلی روبین
برای اندازه‌گیری بیلی روبین نیز از دستگاه اسپکتروفتومتری با طول موج ۵۷۸ نانومتر(بیلی روبین توتال) استفاده شد. نمونه انتخاب شده سرم بود که می بایستی از نور مستقیم به دور نگه داری می شد. طرز تهیه و روش محاسبه آن با بهره گرفتن از کیت تجاری ساخت شرکت درمان کاو انجام شد.
۳-۸-۸- روش تجزیه و تحلیل آماری
ویژگی‌های فردی آزمودنی‌ها با بهره گرفتن از روش های آمار توصیفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سپس با بهره گرفتن از آزمون کلموگروف- اسمیرنف از طبیعی بودن جامعه اطمینان حاصل شد. برای ارزیابی ایجاد شده در متغیرهای وابسته از روش تحلیل واریانس دو طرفه با اندازه‌گیری مکرر (۵×۲) استفاده شد. منظور از عدد دو تعداد گروه ها و عدد پنج تعداد سری‌های زمانی اندازه‌گیری می‌باشد. جهت تعیین تغییرات زمانی در هر گروه روش اندازه‌گیری مکرر با تصحیح بونفرونی مورد استفاده قرار گرفت و سطح معنی‌داری ۰۵/۰>P در نظر گرفته شد.
فصل چهارم
تجزیه و تحلیل یافته ها
فصل چهارم