فیلتر با منفذ ۴۵/۰ میکرومتر ( PTFE) و قطر ۲۵میلی­متر

آلمان

لامپ مادون قرمز (IR)

فیلیپس/ هلند

اسپکتروفتومتر FTIR

ترمونیکلات/ آمریکا

میکروسکوپ الکترونی FE-SEM

هیتاچی/ ژاپن

اسپکتروفتومتر مرئی– فرابنفش

سیسیل/ ایتالیا

فهرست تجهیزات به همراه شرکت­های سازنده در جدول ۲-۲ قابل مشاهده است.
جدول ۲-۲: لیست تجهیزات مورد استفاده
۲-۳٫ روش­ها

۲-۳-۱٫ عامل­دار کردن نانولوله‌ها

در این تحقیق، جهت عامل­دار کردن نانولوله‌های کربنی از روش اکسیداسیون با اسید نیتریک ۳۵% استفاده شد. در این روش، ml 5 از اسید نیتریک ۳۵% را به mg 3 از هر یک از نانولوله‌های خریداری شده اضافه کرده و در سونیکاتور قرار داده شد. بعد از گذشت ۵ ساعت نانولوله‌ها را از سونیکاتور خارج نموده، فیلتراسیون انجام شد. در این مرحله از فیلترهایی از جنس پلی تترا فلوئورو اتیلن (PTFE) برای فیلتر نانولوله‌ها استفاده شد. در حین کار مرتب آب مقطر به محلول اضافه کرده تا PH آن به ۷ برسد و کاملاً خنثی شود و اسید نیتریک اضافی از بین برود. بعد از اتمام فیلتراسیون در شرایط خلأ نانولوله‌های جمع شده در روی فیلتر را خراشیده شد و در یک شیشه ساعت جمع آوری شد. سپس، نانوله­ها زیر لامپ IR که از قبل آماده شده بود، قرار داده شد تا کاملاً خشک شوند. نانولوله‌های عامل دار شده‌ در مراحل بعدی کار مورد استفاده قرار گرفت.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

الف ب ج
شکل ۲-۱٫ الف) نانولوله‌های کربنی عامل دار شده در اسید نیتریک ۳۵% بعد سپری شدن زمان سونیکاسیون ب) نانولوله‌ی کربنی عامل­دار شده بعد از عبور از سیستم فیلتراسیون روی فیلتر ج) نانولوله‌ی کربنی عامل­دار شده بعد از فیلتراسیون زیر لامپ IR جهت خشک شدن.
شکل ۲-۲٫ دستگاه فیلتراسیون استفاده شده در این تحقیق

۲-۳-۲٫ تهیه سوسپانسیون نانولوله کربنی

برای تهیه سوسپانسیون نانولوله کربنی، mg 1 از نانولوله‌ی عامل دار شده را وزن کرده و به آن mL 5/0 DMF (NوN– دی متیل فرمامید) اضافه شد تا غلظت نهایی mg/ml2 از نانولوله‌ها به دست آید. سپس، این سوسپانسیون حدود ۲۰ دقیقه در مجاورت امواج اولتراسونیک قرار داده شد، تا سوسپانسیون نسبتاً یکنواخت از آن به دست آید.

۲-۳-۳٫ آماده سازی الکترود

برای انجام این مرحله ابتدا بایستی الکترودهای کربنی شیشه‌ای را که از قبل تهیه شده‌اند، برای تثبیت نانولوله‌های کربنی آماده کرد. آماده سازی الکترودها به این طریق است که ابتدا برای سایش سطح الکترود، به منظور از بین بردن لایه­ای که قبلا روی آن تثبیت شده بود، مقداری از پودر آلومینا را در مقداری آب حل کرده و روی پارچه‌ی مخصوصی که برای این کار تهیه شده است ریخته و سطح الکترودها را توسط آن‌ می‌ساییم.

۲-۳-۴٫ روش تثبیت

بعد از آماده شدن الکترود برای تثبیت، مقدار Lµ ۵ از نمونه‌ی نانولوله‌ی عامل­دار شده به دقت روی الکترود کربنی قرار داده شد و صبر کردیم تا به خوبی خشک شود. این مرحله زمان زیادی نیاز نداشت. در مرحله‌ بعد، مایع یونی را روی الکترودی که نانولوله را روی آن تثبیت شده بود Cap کرده و مدت ۱۲ ساعت در دمای ۴ درجه قرار داده شد. بعد از این مدت الکترود را از یخچال خارج کرده و به آرامی داخل یک ویال آب مقطر چند بار به آرامی شستشو داده شد، در مرحله آخر آنزیم روی الکترود تثبیت شد. آنزیم کولین اکسیداز را به مقدار mg/ml6 در بافر فسفات M 2/0 که از قبل به صورت استریل تهیه شده بود، حل کرده و مانند مرحله قبل روی الکترود به صورت Cap قرار داده و حداقل به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۴ درجه قرار داده شد. بعد از گذشت این زمان الکترود کربنی که آنزیم روی آن تثبیت شده آماده برای انجام ولتامتری چرخه‌ای است. لازم به ذکر است بعد از هر مرحله تثبیت، ولتامتری چرخه‌ای از الکترود به عمل آمد،تا از تثبیت آنالیت مورد نظر اطمینان حاصل شود.

۲-۳-۵٫ مطالعات ولتامتری فیلم پروتئین

در این مرحله الکترود کار طبق پروسه تثبیت با نانولوله‌های عامل­دار شده، مایع یونی و آنزیم اصلاح شده است. بعد از تنظیم دستگاه و قرار دادن الکترودهای رفرنس (Ag/AgCl) و کمکی (پلاتین)(الکترود کمکی برای این است که مدار کامل و جریان اندازه گیری شود) و کار (کربن شیشه‌ای اصلاح شده)، ابتدا به مدت ۱۵ دقیقه گاز نیتروژن از محلول مورد آزمایش عبور داده شد و در طول مدت انجام آزمایش نیز سل مورد استفاده زیر جو نیتروژن قرار داده شد. ثبت ولتاموگرام­ها در محدوده پتانسیل مختلف و در سرعت‌های روبش پتانسیل از mVs^-110 تا Vs^-11 صورت پذیرفت. در مطالعات الکتروشیمیایی از روش‌های ولتامتری چرخه‌ای و آمپرومتری استفاده شد. در آزمایش­های آمپرومتری، از محلول سوبسترای آنزیم یعنی کولین با غلظت‌های مختلف، از غلظت‌های کم به زیاد، استفاده شد و این کار را تا زمانی ادامه یافت که آنزیم کاملاً اشباع شود.

۲-۳-۶٫ اندازه گیری فعالیت آنزیم

به منظور حصول اطمینان از فعال بودن آنزیم، از روش استانداردی که شرکت سیگما پیشنهاد کرده است، استفاده شد. در این روش از دستگاه طیف سنج مرئی– فرابنفش (Cecil) استفاده شد. برای اندازه گیری فعالیت آنزیم ابتدا استوک آن با غلظت mg/ml 6 در بافر فسفات ۲/۰ مولار با ۸pH= تهیه شد. محلول اندازه گیری فعالیت آنزیم که محتوی units/mg 5 پراکسیداز، ۴-آمینو آنتی پیرین mM 50 و کولین کلراید mM 150، به عنوان سوبسترای آنزیم و اتیلن دی آمین تترا استیک اسید mM 2 بود، تهیه گردید. با اضافه کردن Lµ ۱۰ از استوک آنزیم به محلول اندازه گیری فعالیت، واکنش آنزیمی شروع شد. شدت رنگ کوئینون ایمین تولید شده، که متناسب با میزان فعالیت آنزیم کولین اکسیداز است، به وسیله طیف سنج در طول موج nm 500 و بازه زمانی یک دقیقه اندازه گیری شده و از فعال بودن آنزیم اطمینان حاصل شد. واکنش­هایی که طی اندازه گیری فعالیت آنزیم صورت می‌گیرد به قرار زیر است:
Choline + O₂ Betaine Aldehyde + H₂O₂
Betaine Aldehyde + O₂ + H₂O Betaine + H₂O₂
۲H₂O₂ + ۴-Aminoantipyrine + Phenol Quinonemine dye + 4 H₂O
شدت رنگ کوئینون ایمین تولید شده، متناسب با میزان فعالیت آنزیم کولین اکسیداز است، به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۰۰ نانومتر و بازه زمانی یک دقیقه اندازه گیری شد. برای محاسبه فعالیت از رابطه زیر استفاده شد:
Enzyme Activity= )dA/dt( /ɛL
در رابطه بالا dA/dt سرعت تغییر جذب نوری ایجاد شده است ،که به وسیله اسپکتروفتومتر وقتی در مد سینتیکی است،قابل اندازه گیری است. L طول مسیر عبور نور ( یک سانتی متر ) و ɛ ضریب خاموشی کوئینون ایمین است، که بر اساس گزارش موجود در منابع برابر با M^-1cm^-112000 است. فعالیت آنزیمی به دست آمده بر حسب واحد بوده و هر واحد فعالیت آنزیمی برابر با تعداد میکرومول‌های محصول ایجاد شده در دقیقه تعریف می‌شود [۷۱].

۲-۳-۷٫ تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی

به این منظور، جهت تثبیت نانولوله‌ها، مایع یونی و آنزیم از الکترودهای چاپیScreen Print) ) استفاده شد، بقیه مراحل آماده سازی هم که شامل ایجاد پوشش طلا روی الکترودهاست توسط اپراتور میکروسکوپ الکترونی مدل SEM S-4160 Hitachi موجود در دانشکده مهندسی برق دانشگاه تهران انجام شد.

فصل سوم

نتایج