NaCl

۰۵/۰

عصاره مخمر

۰۵/۰

تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

سویه‌های اکتینومیست منتخب در محیط تهیه شده در بخش ‏۳-۲۰-۱- کشت داده شد و در شیکر انکوباتور^OC28 با دور rpm220 گرماگذاری شدند. پس از ۴۸ ساعت از ارلن‌ها لام گرفته شد و رنگ آمیزی با کریستال ویوله انجام شد و از آلوده نبودن ارلن‌ها اطمینان حاصل شد، توده‌زیستی باکتری‌ها با کمک سانتریفوژ از محیط کشت جدا شد. توده‌زیستی دو بار با آب مقطر شستشو داده شد و آب، کاملا خارج گردید. برای اطمینان بیشتر، ویال‌ها ۱۵ تا ۲۰ دقیقه با درپوش باز زیر هود قرار داده شدند.
استخراج DNA
استخراج DNA، طبق روش Saltingout پیشنهاد شده توسط Kisser و همکاران با کمی تغییر مورد استفاده قرار گرفت (۳۶). برای این منظور، ابتدا محلول‌های زیر تهیه شد:
SET buffer: Tris-HCl20 میلی مولار، EDTA 25میلی مولار با۸ pH، NaCl 75 میلی‌مولار
محلول لیزوزیم ۰۵/۰ گرم در میلی‌لیتر
محلول SDS(سدیم دودسیل سولفات) ۱۰%
محلول سدیم استات ۳ مولار با ۵ pH
۲۰۰-۱۰۰ میلی گرم از توده زیستی را در ویال ۵/۱ میلی‌لیتری ریخته شد و ۹۵۰ میکرولیترSet buffer و۵۰ میکرولیتر از محلول لیزوزیم افزوده شد و پس از ۵ ثانیه ورتکس، ویال در انکوباتور^ºC37 به مدت یک ساعت گرماگذاری شد. EDTA موجود در Set buffer از عمل نوکلئازها جلوگیری می‌کند و تریس، برای تنظیم pH لازم است. در طول این مدت ویال‌ها هر یک ربع یک‌ بار برای ۲-۵ ثانیه ورتکس شد. پس از پایان این مدت، محتوای ویال تقریبا به صورت همگن و لزج درآمد. سپس به ویال مورد نظر۱۰۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر SDS10% افزوده شد و یک ساعت در حمام آب گرم با دمای ºC60 قرار داده شد. SDS لیپیدهای غشا را حل می کند. در پایان این مرحله محتوای ویال به صورت شفاف شد و محتوای سلولی از بین رفت. اجساد سلولی با بهره گرفتن از میکروفیوژ با دورrpm13500به مدت ۱۰ دقیقه از عصاره سلولی جدا شد. محلول رویی حاوی RNA،DNA و لیپید می‌باشد، این محلول به یک ویال ۵/۱ میلی لیتری تمیز انتقال داده شد و در زیر هود شیمیایی هم حجم محلول رویی جمع آوری شده، محلول فنل-کلرفرم اشباع با نسبت یک به یک اضافه شد. ویال حاوی محلول را در دست گرفته و به مدت دو دقیقه تکان داده شد، سپس سانتریفوژ در rpm13500 به مدت پنج دقیقه انجام شد. کلروفرم، لیپیدهای باقی مانده را حل کرده و فنل پروتئین‌زدایی می‌کند. در ادامه مجددا در زیر هود شیمیایی مایع رویی جمع آوری شد و به یک ویال ۵/۱ میلی‌لیتری انتقال داده شد و هم حجم محلول رویی جمع آوری شده، کلرفرم اضافه شد و دو دقیقه به آرامی با دست تکان داده شد، سپس پنج دقیقه در rpm13500سانتریفوژ شد. پس از انتقال محلول رویی به ویال تمیز دیگر، یک دهم حجم محلول داخل ویال، محلول سدیم استات ۳ مولار با ۵ pH و سه برابر آن اتانول ۹۶ % سرد اضافه شد و سی دقیقه در^ºC20- قرار داده شد. کدر شدن محتوای ویال پس از افزودن اتانول نشانه حضور DNA است.
پس از اتمام سی دقیقه و سانتریفوژ به مدت ۱۵ دقیقه با دور rpm15000 و خالی کردن الکل، رسوب سفید چسبیده به ته یا دیواره ویال با ۱۰۰۰-۵۰۰ میکرولیتر اتانول۷۰% سرد شستشو داده شد و سانتریفوژ با شرایط قبلی تکرار شد. سپس فاز الکلی خالی شد و برای آبگیری ویال ، به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه با درپوش باز روی کاغذ صافی در دمای محیط قرار داده شد. در مرحله آخر DNA حاصل در ۱۰۰-۵۰ میکرولیترآب مقطر استریل حل شد و تا زمان استفاده در ºC20- نگهداری شد.
تائید بررسی کیفیت استخراج DNA
به منظور بررسی موفق بودن عمل استخراج DNA، الکتروفورز با ژل آگارز ۱% انجام شد.
تهیه ژل آگارز
برای تهیه ژل آگارز ۱%، ۲/۱ گرم آگارز در ۱۲ سی سی بافر x TAE1 روی حرارت شعله حل شد. هنگامی که دمای محلول ژل آگارز در محیط به دمای ^ºC60-50 رسید، شانه را در ظرف الکتروفورز قرار داده و ژل در ظرف ریخته شد. پس ازکامل بسته شدن ژل، شانه را با احتیاط و به صورت عمودی خارج شد و ظرف ژل به تانک الکتروفورز حاوی بافر x TAE1 منتقل شد. بافر باید به اندازه ای باشد که کاملا روی چاهک ها را پر کند. سپس ۲ میکرولیتر از هر کدام از نمونه‌های DNA ژنومی استخراج شده با ۲ میکرولیترloading dye (رنگ) روی پارافیلم مخلوط شد و درون چاهک ها قرار داده شد. در یکی از چاهک‌ها نیز ۲ میکرولیتر شاخص وزن مولکولی^[۷۱] ، به منظور مقایسه سایز و غلظت نمونه‌های سایر چاهک‌ها با آن قرار داده شد. برای آماده سازی شاخص وزن مولکولی، آب مقطر، loading dye و شاخص وزن مولکولی به نسبت ۴:۱:۱ با هم مخلوط شد. پس از قرار دادن نمونه‌ها در داخل چاهک‌ها، الکتروفورز با جریان V/CM 7 به مدت ۳۰ دقیقه انجام شد. سپس ژل به ظرف حاوی اتیدیوم برماید g/mlμ۱ منتقل شد و پس از ۵ تا ۱۰ دقیقه، ژل با آب شستشو داده شد و در دستگاه ژل داک قرار داده شده و از آن عکس گرفته شد.
تهیه بافر Tris-acetate-EDTA(TAE)
برای آماده سازی بافر x TAE1، ابتدا بافرx TAE50 ساخته و با بهره گرفتن از آب مقطر به غلظت x1 رسانده شد. به منظور تهیه بافر x TAE50، به ۱۰۰ میلی لیتر محلول۰٫۵M EDTA با ۸ pH، ۵۷ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و ۲۴۲ گرم تریس قلیایی افزوده شد و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد.
انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)
پرایمر‌ها
پرایمرها باید دمای ذوب ™ نزدیک به هم و نیز دمای اتصال (Ta) مشابه با رشته الگو داشته باشند. برای ویژگی بیشتر بهتر است میانگین محتوای G+C آنها ۶۰-۴۰% باشد. وجود ساختارهای ثانویه (با ΔGمنفی اندازه‌گیری می‌شوند) چه در ناحیه اتصال با پرایمر و یا ناحیه فرودستی و یا ناحیه فرادستی رشته الگو در تکثیر کارا تداخل ایجاد می‌کند. توالی‌های پالیندرومی درون پرایمرها نباید دیده شود. غلظت ۵/۰-۱ میکرومولار پرایمر مناسب بوده و در غلظت‌های بالا محصولات غیر اختصاصی ایجاد شده و غلظت‌های کم منجر به رقابت در طویل شدن توالی‌های مکمل یا طویل شدن پرایمر می‌شود که درنهایت منجر به کاهش بازده محصول می‌شود.
برای تکثیر ژن ۱۶S rRNA باکتری‌ها از پرایمرهای عمومی (Universal) تغییر یافته استفاده شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در این پژوهش و دمای اتصال مربوط به آنها به ترتیب زیر است:
۹F: 5’- AAG AGT TTG ATC ATG GCT CAG -3’ (Tm:60)
۱۵۴۱R: 5’- AGG AGG TGA TCC ACC CGC A -3’ (Tm:60)
با بهره گرفتن از این پرایمرها ژن ۱۶S rRNA باطول حدود ۱۵۰۰ نوکلئوتید تکثیر می‌شود (۳۹ ).
شرایط واکنش PCR
برای تکثیر DNA از آنزیم Master Mixاستفاده شد. واکنش PCR طبق روش استاندارد انجام گرفت. دناتوره شدن اولیه در دمای ^oC96 و مدت زمان آن ۵ دقیقه بود.۳۰ چرخه تکثیر شامل ۴۵ ثانیه در دمای ^oC94، ۵۵ ثانیه در دمای^oC57 و ۷۵ ثانیه در دمای ^oC72 انجام شد. پس از این مراحل ۱۰ دقیقه دما در ^oC72 به منظور تکمیل نهایی سنتز DNA نگه داشته شد
بررسی محصولات PCR
در این مرحله نیز بررسی محصولات PCR با بهره گرفتن از ژل آگاروز۱% و دستگاه الکروفورز مطابق بخش‏۳-۲۰-۴- انجام شد.
خالص سازی محصولات PCR
خالص سازی محصولات PCR سبب حذف پرایمرها، نوکلئوتیدها، ترکیبات بازی، محصولات تکثیر شده ناخواسته و ترکیباتی که واکنش اتصال را مهار می‌کنند، می‌شود. مهمترین عیب آن از دست رفتن بخشی از محصول واکنش است. در هر صورت عدم انجام این مرحله ممکن است موجب باقی ماندن ناخالصی‌ها و کاهش کیفیت در مرحله توالی‌یابی شود، به همین منظور و نیز افزایش غلظت محصول، خالص‌سازی DNA حاصل از PCR این کار با بهره گرفتن از کیت خاص سازی (Geneall) انجام گرفت.
تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن ۱۶S rRNA
محصولات خالص PCR به صورت یک طرفه و فقط با پرایمر۹F تکثیر شد. سپس برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن (کره جنوبی) ارسال شد.
مقایسه توالی نوکلئوتید ژن ۱۶S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب
برای بررسی نتیجه­ توالی­ها، توالی­های ژن۱۶S rRNA ، با بهره گرفتن از نرم­افزار BioEdit مرتب شده و سپس توسط برنامه­یChromas pro مورد بررسی قرار گرفت. برای شناسایی مولکولی سویه های برتر از انطباق توالی بدست آمده در EZ-Taxon Server Version 2.1 استفاده شد.
فصل چهارم:
نتایج
نتایج
دراین فصل نتایج مربوط به هر مرحله از فعالیت‌های پژوهشی به همراه بررسی‌های آماری آن ارائه می‌شود.
شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط۴۰ سویه اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش
نتایج مربوط به شرایط پیش تخمیر و تخمیر و مقدار متابولیت ثانویه تولید شده توسط ۴۰ سویه اکتینومیست، که به صورت تصادفی انتخاب شد، به همراه نتایج محاسبه انحراف معیار (SD)، pH محیط ‌های پیش تخمیر و تخمیر محاسبه شد و درجدول ۴-۱ نشان داده شده است.
جدول ‏۴‑۱:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه