۲۷۴ bp

Matsunaga
et al. (1999)

Sheep primer

cytochrome b

(۵’- CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA-3′)].

۳۳۶bp

Matsunaga
et al. (1999)

Soya primer

lectin

۵´GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3´
۵´GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3´

۱۱۸ bp

Abd El-Nasser
et al. (2010)

جدول ۲-۱-توالی آغازگر ها و اندازه قطعات تکثیر یافته با هر آغازگر در هر گونه
۲-۸-انجام واکنش های PCR
۲-۸-۱-تهیه مخلوط اصلی
تهیه کردن مخلوط اصلی سبب می شود تا یکنواختی شرایط آزمایش برای نمونه های مختلف افزایش یابد و از طرفی دیگر آلودگی را به دلیل کاهش دفعات استفاده از سرسمپلر، میکروتیوب و … کاهش می دهد. بعد از مشخص شدن حجم هر واکنش، مخلوط اصلی تهیه شد. حجم و غلظت نهایی اجزای PCR برای واکنش µl25 در جدول ۲-۲ ذکر شده است. بر این اساس آماده کردن مخلوط اصلی به صورت زیر انجام شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

پس از محاسبه حجم هر واکنش، تعداد نمونه های مورد بررسی با احتساب کنترل منفی مشخص شد. سپس حجم هر یک از اجزای واکنش در مخلوط اصلی برای تمام نمونه ها (معمولاً بیشتر از تعداد کل) محاسبه شد. قابل ذکر است که کلیه مراحل تهیه مخلوط اصلی روی یخ انجام شد. هم چنین تمامی مواد غیر از DNA و آنزیمTaq پلیمراز پس از ذوب شدن با چند تکان بسیار آرام مخلوط شده و تحت چرخش قرار گرفتند.
۲-۸-۲-‎ Simplex PCR
با توجه به توضیحات این روش در بخش مقدمه، برای این نوع از PCR یک آغازگر(گاو یا گوسفند یا مرغ یا سویا) استفاده می شود که آن آغازگرها فقط باید با DNA استخراج شده از یک گونه (گاو یا گوسفند یا مرغ یا سویا) چه در نمونه های شاهد و چه در نمونه های کباب لقمه، واکنش دهد.
۲-۸-۲-۱-Simplex PCR نمونه های شاهد جهت تأیید اختصاصی بودن آغازگرها
با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی هر گونه شاهد (گاو، گوسفند، مرغ و سویا) و ‏DNA‏ استخراج شده از آن ها، اختصاصی بودن هر آغازگر مورد آزمایش قرار گرفت. یعنی در یک مرحله (با ۳ بار تکرار آزمون) آغازگر هر گونه با ‏DNA‏ ‏مخصوص همان گونه تکثیر شد و در مرحله ای دیگر برای تائید عدم واکنش متقاطع (با ۳ بار تکرار آزمون) آغازگر هر گونه با DNA مخصوص همان گونه(هدف) به همراه ‏DNA‏ های دیگر(یعنی غیر هدف) در یک ‏PCR‏ تکثیر گردید که (cross reaction)انتظار ما این بود که آغازگر هر گونه فقط ‏با ‏DNA‏ مخصوص همان گونه(هدف) واکنش دهد. ‏

مواد واکنش

حجم(‎µl‎‏۲۵ ‏)

مخلوط اصلی امپلیکون‏

۵/۱۲ (ماکرولیتر)

آغازگر خاص هر گونه(reverse‎ )‏

۵/۰(میلی مولار)

آغازگر خاص هر گونه(forward‎)

۵/۰ (میلی مولار)

DNA‏ الگو‎ ‎
آب مقطر تزریقی