۴-۳-۱- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تایید وجود ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت ۳۹

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۴-۴- استخراج RNAو ساخت cDNA 40
۴-۵- انجام Real Time PCR 42
۴-۵-۱- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین ۴۲
ویروس موزاییک خیار ۴۳
۴- ۴۶
۶- بحث ۴۷
۷- منابع ۴۹
فهرست جدول‌ها
عنوان …………. صفحه
جدول ۳-۱- محول ضدعفونی کننده بذر توتون ۱۶
جدول ۳-۲- تهیه ی بافر استخراج DNA 19
جدول ۳-۳- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین ۲۰
جدول ۳-۴- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21
جدول ۳-۵- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR 22
جدول ۳-۶- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase 25
جدول ۳-۷- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA 26
جدول ۳-۸- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA 27
جدول ۳-۹- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی ۲۷
جدول ۳-۱۰- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…… ۲۸
جدول ۳-۱۱- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی ۲۹
ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی ۳۰
ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی ۳۰
جدول ۴-۱- تاخیر ظهور علایم پس از ۱۵ روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت ۳۶
فهرست شکل ها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه
شکل ۴-۱- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی ۳۳
شکل ۴-۲- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها ۳۴
شکل ۴-۳- گیاهان تیپ وحشی بعد از ۳۰ روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۴
شکل ۴-۴- گیاهان تراریخت پس از ۱۵ روز از ظهور علایم در تیپ وحشی­ها ۳۵
شکل ۴-۵- آزمون الایزا در زمان صفر ۳۷
شکل ۴-۶- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در ۲۰ روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۸
شکل ۴-۷- آزمون الایزا در زمان ۳۰ روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۹
شکل ۴-۸- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین ۴۰
شکل ۴-۹- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۰
شکل ۴-۱۰- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین: ۴۱
شکل ۴-۱۱- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از ۲۲ روز از مایه زنی باکتری ۴۱
شکل ۴-۱۲- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاین­های تراریخت ۴۲
ویروس موزاییک خیار ۴۳
شکل ۴-۱۴- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۴
شکل ۴-۱۵- پژمرده گی گوجه پس از ۲۶ روز از مایه زنی باکتری ۴۵
۴۵
۴۵
فصل اول
۱-­ مقدمه
براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماری­ها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین ۳۱ تا ۴۲% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آن­ها جلوگیری می­ کنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را ۵/۳۶% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب ۱/۱۴%، ۲/۱۰% و ۲/۱۲% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی ۱/۱۴% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آن­ها در سطح جهانی بالغ بر۲۲۰ میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).
طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماری­ها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده­ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماری­های گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفاده­ی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزم­های بیماری­زا زندگی کرده و به ریشه­ گیاه حمله می­ کنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزم­های غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینه­ های بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و به­زیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری می­ کنند. دامنه­ اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروه ­های عمده بیمارگرها شامل ویروس­ها، باکتری­ ها، قارچ­ها، اوومیست­ها، ویروس­ها و نماتدها می­باشند. کنترل عوامل بیماری­زای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آن­ها به وجود می ­آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راه­حل­هایی بود. در سطح زیستی نیاز به روش­هایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کننده­، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم ­های بیماری­زایی می­باشد. در مرحله­ بعد خسارت بیماری باید به وسیله­ کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماری­زایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهش­های جدید در بیماری­شناسی گیاهی یافتن شیوه ­های دیگر برای کنترل بیماری­های گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روش­های انتقال در سال­های اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید ­بخش­ترین این روش­ها عبارتند از: