برای سنجش فعالیت آنزیم ۶۰ میکرولیتر از گلیسرول حاوی نمونه از یخچال ۸۰- برمیداریم و به ۵ میلی لیتر از محیط LB انتقال می دهیم. این محیط را به مدت یک روز در شیکر انکوباتور می گذاریم. سپس ۱۰۰۰ میکرولیتر از هر محیط LB برمی­داریم در ۱۵ میلی لیتر از محیط کشت اولیه حاوی کوتین در هر فالکون می­ریزیم ودر شیکر انکوباتور قرار می­دهیم و بعد از رشد نمونه ها، در ۴۰۵ نانومتر اسپکت می­گیریم.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

برای assay باید دو بافر تهیه می­کنیم:
بافر یک: ۰۱۷/۰ گرم KH₂PO₄ (merk5/99%)در ۵ میلی لیتر آب حل می­کنیم ( بافر فسفات) بعد pH را در ناحیه­ی ۵/۷ تنظیم می­کنیم. سپس ۵/۲میکرولیتر تریتونX_100 اضافه می­کنیم.
بافر دو: ۰۱۷/۰گرمKH₂PO₄ (merk5/99%) در ۵ میلی لیتر آب حل می­کنیم ( بافر فسفات) بعد pH را در ناحیه­ی ۵/۷ تنظیم می­کنیم. سپس ۲۵ میکرولیتر تریتونX_100 و ۸ میکرولیتر PNPBاضافه می­کنیم.
فالکون­های حاوی نمونه را ۹۰۰۰ دور به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ می­کنیم.
نمونه: در یک ویال ۷۰۰ میکرولیتر بافر یک، ۱۰۰ میکرولیتر بافر دو و ۲۰۰ میکرولیتر از نمونه موجود در محیط مایع سانتریفیوژ شده مرحله قبل می­ریزیم.
به منظور تهیه Blank : 200 میکرولیتر از هر نمونه موجود در فالکون را در یک ویال می­ریزیم به مدت ۵ دقیقه در آب در حال جوش می­گذاریم سپس به انها ۷۰۰ میکرولیتر بافر یک و ۱۰۰ میکرولیتر بافر دو می­ریزیم.
بعد از تهیه نمونه و Blank به منظور تست دوم شناسایی باکتری­ های دارای فعالیت کوتینازی، نیم ساعت صبر کرده و میزان جذب نمونه­ها را می­خوانیم. نمونه­های دارای جذب، نشان دهنده وجود انزیم کوتیناز در آنها می­باشد [۸۴].
Assay ویژه آنزیمی
از نمونه­های غربالگری شده­ای که قبلا ثابت شده است فعالیت آنزیمی دارد استفاده می­کنیم.
بدین منظور برای سنجش فعالیت آنزیم ۸۰ میکرولیتر از گلیسرول حاوی این نمونه­ها را از یخچال ۸۰- برمیداریم و به ۵ میلی لیتر از محیط LB انتقال می­دهیم به مدت یک روز در شیکر انکوباتور گذاشته و سپس ۵ دقیقه با دور ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­کنیم در مرحله ی بعد سوپ رویی را دور می­ریزیم و مابقی را به ۵ میلی لیتر محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیسم­ها است انتقال می­دهیم و به مدت ۴ تا ۵ روز در شیکر انکوباتور با دمای ۳۰ درجه و ۱۵۰rpm انتقال می­دهیم. مانند مرحله قبل، در یک ویال نمونه و در یک ویال Blank را تهیه می­کنیم و از لحظه صفر تهیه نمونه به مدت نیم ساعت، هر یک دقیقه یکبار میزان فعالیت آنزیم را بررسی می­کنیم. در نهایت داده ­ها را وارد excel کرده و از طریق معادلات انزیمی میزان فعالیت هر آنزیم را محاسبه می­کنیم.
استخراج DNA
به منظور استخراج DNA جهت انالیز ۱۶sDNA و نشانگر RAPD از روش­های مختلفی از قبیل جوشاندن،CTAB و کیت استفاده شد که مراحل هر کدام در زیر امده است.
استخراج DNA به روش جوشاندن
۳۰ میکرو از گلیسرول مایع را به ۵ میلی لیتر از محیط LB تلقیح می­کنیم به مدت ۲۴ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۰ درجه سانتیگراد با ۱۵۰rpm قرار می­دهیم و سپس ۱ میلی لیتر از هر کدام را در ویال ریخته و به مدت ۵ دقیقه rpm 1000سانتریفیوژ می­کنیم فاز رویی را دور ریخته و ۲۰۰ ماکرو آب دوبار تقطیر به آنها اضافه می­کنیم و ورتکس می­کنیم تا کامل حل شود و سپس ۱۵ دقیقه در اب ۹۰ درجه گذاشته و سپس ۵ دقیقه در روی یخ می­گذاریم و سپس ۱۵ دقیقه آب ۹۰ درجه و ۵ دقیقه یخچال ۸۰- و در نهایت برداشته و به مدت ۵ دقیقه با ده هزار دور سانتریفیوژ می­کنیم سوپرناتانت رویی را که همان DNA است را بر می­داریم و در یخچال ۲۰- درجه قرار می­دهیم.
استخراج DNA به رو ش CTAB
قبل از انجام مراحل استخراج DNA، محلول­ها و بافرهای مورد نیاز به شرح زیر تهیه شدند.

1. 1. نیتروژن مایع

1. 1. بافر استخراج CTAB: (100میلی­لیتر Tris-HCl 1مولار با PH=8، ۲۸۰میلی­لیتر NaCl 5مولار، ۴۰ میلی­لیتر۵/۰ EDTA مولار، ۲۰ گرم CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) به حجم نهایی ۱ لیتر رسانده شود.

1. 1. کلروفرم – ایزو آمیل الکل به نسبت ۲۴ به ۱

1. 1. ایزو پروپانول ۱۰۰%

1. 1. اتانول ۱۰۰%

1. 1. استات آمونیوم ۵/۷ مولار

1. 1. محلول TE: (میلی­لیتر Tris-HCl 1مولار با PH=8،۲ میلی­لیتر EDTA 0.5 مولار و با H₂O دوبار تقطیر شده به حجم ۱ لیتر برسد).

مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA در ‏جدول ۳-۲ شرح داده شده است
.
جدول ‏۳‑۲ مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA

نام اختصاری

نام کامل

فرمول شیمیایی

جرم مولکولی

شرکت تولیدکننده

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt 2-hydrat

C10H14N2Na2O82H2O

M=372.24
g/mol

Merck

Tris