شکل ۳: خسارت شته سیاه باقلا

همچنین این شته ناقل بیماری ‌های ویروسی،‌ مانند ویروس پیچیدگی برگ سیب ‌زمینی، ویروسY سیب‌ زمینی روی گیاهانِ تیره Solanaceae، ویروس‌ های زردی و زردی غربی چغندرقند روی گیاهانِ تیره Chenopodiaceae و ویروس ‌های موزائیک خیار و طالبی روی گیاهانِ تیره Cucurbitaceae می ‌باشد (Schepers, 1989).

۱-۲- معرفی گیاه میزبان

گیاه باقلا با نام علمی Vicia faba Linnaeus متعلق به رده دولپه‌ ای‌ ها^[۲] ،‌ راسته Fabales،‌ خانواده Fabaceae، زیر خانواده Faboideae و قبیله Vicieae می باشد. این گیاه بومی شمال آفریقا و جنوب غربی آسیاست. این گیاه در ایران، در نواحی شمالی و بخش های مرکزی کشت می‌ شود.

باقلا گیاهی است با ساقه‌ های قطور و سطح مقطع مربعی که بلندای آن به ۸/۱- ۵/۰ متر می ‌رسد. برگ ‌ها ۲۵-۱۰ سانتی ‌متر، ‌در دو سوی دمبرگ با ۷-۲ برگچه به رنگ ‌های سبز مایل به زرد تا خاکستری دیده می ‌شوند. ‌برخلاف بسیاری از نخودیان^[۳]، ‌برگ های این گیاه برای بالا رفتن از دیگر گیاهان، پیچک ندارند. گل های آن به طول ۵/۲-۱ سانتی‌ متر، با پنج گلبرگ می باشند. گلبرگ اصلی سفید و گلبرگ ‌های کناری سفید با یک نقطه سیاه (‌سیاه حقیقی است، و مانند موارد دیگر بنفش یا آبی تیره نیست) هستند (Onslow, 1916). باقلای قرمز^[۴] دارای گل ‌هایی با عطر و بوی شیرین است که برای زنبورها و حشرات گرده افشان جذاب می باشد. میوه‌ ها داخل غلافی چرمی قرار دارند و در مرحله بلوغ به رنگ سبز تا قهوه ‌ای مایل به سیاه می ‌باشند. در گونه ‌های وحشی غلاف ۱۰-۵ سانتی‌ متر طول و یک سانتی ‌متر قطر دارد؛ ‌اما غلاف در بسیاری از ارقام که برای استفاده به عنوان ماده غذایی اصلاح شده اند، ۲۵-۱۵ سانتی ‌متر طول و ۳-۲ سانتی ‌متر قطر دارد (شکل ۴).

شکل ۴: تصاویری از گل، برگ، غلاف و بذر گیاه باقلا Vicia faba L.

۱-۳- مشکلات آفت‌کش های شیمیایی و علل جایگزینی آن ‌ها با عصاره ‌های گیاهی

شته سیاه باقلا یکی از آفات محصولات زارعی چند کشتی^[۵] در سراسر جهان است (Volk and Stechmann, 1998). این شته دامنه میزبانی وسیعی دارد و بیش از ۲۰۰ گونه گیاهی در جهان و حدود ۵۰ گونه گیاهی در ایران نسبت به حمله این شته حساس می ‌باشند (Hodjat, 1986; Cab International, 2000) .

چغندرقند Beta vulgaris Linnaeus یک محصول مهم در ایران است که آسیب‌ های ناشی از شته سیاه باقلا کمیت و کیفیت محصول را به شدت کاهش می دهد. گیاهان میزبانی نظیر چغندرقند یا به طور مستقیم با تغذیه از شته و یا به طور غیر مستقیم توسط انتقال ویروس ‌ها و دفع عسلک آسیب می ‌بینند (Mills, 1989; Schepers, 1989).

شته سیاه باقلا در حال حاضر به طور عمده با حشره‌کش ‌های وسیع الطیف مدیریت و کنترل می ‌شود. این امر می ‌تواند طغیان مجدد آفت هدف، ‌شیوع آفات ثانویه و توسعه مقاومت به حشره کش ‌ها در آفت هدف را به دنبال داشته باشد (Schepers, 1989; Hardin et al., 1995; Longley et al., 1997).

کابرد سموم غیر انتخابی، ‌باعث نابودی دشمنان طبیعی شده و این امر سبب گسترش روز افزون آفات می ‌شود. از سوی دیگر استفاده نادرست و افراطی از آفتکش ‌ها اثرات نامطلوب بر اکوسیستم کشاورزی و همچنین سلامتی انسان دارد. به علاوه، باقی‌ مانده آفتکش ‌ها در فراورده ‌های کشاورزی،‌ مخصوصا سبزیجات و میوه ‌های تازه می تواند باعث افزایش بروز سرطان در انسان شود (Fitriasari and Prijono, 2009).

با توجه به مشکلات ذکر شده، پیدا کردن روشی اَمن، مؤثر و طبیعی برای کنترل آفات یک نیاز ضروری است. استفاده از مشتقات گیاهی یکی از روش ‌های پیشنهادی برای کنترل آفات است. فراورده‌ های گیاهی مناسب، ‌علاوه بر داشتن قابلیت تجزیه پذیری و مؤثر بودن علیه آفات،‌ به حشرات مفید آسیب نمی ‌رسانند (Hasseeb et al., 2004). گیاهان در طی تکامل و تطابق با محیط زیست، روش های دفاع بیوشیمیایی بسیار پیچیده ای را بدست آورده اند که موجب فراهم شدن یک منبع غنی از ترکیبات فعال بیولوژیکی شده است. با روش هایی مناسب، می توان از این منابع به عنوان حشره کش های جدید استفاده کرد (Mareggiani et al., 2000). به ویژه ترکیبات آللوکمیکال^[۶] گیاهی که باعث ایجاد طعم نامطبوع و جذابیت کمتر درگیاهان می شوند (Saxena, 1987; Silva et al., 2002). مهم ترین خاصیت ترکیبات گیاهی این است که اکثرا فاقد سمیت یا دارای سمیت کم برای موجودات غیر هدف و پستانداران بوده و خطرات کمتری برای محیط زیست دارند (Wei et al., 2011). ترکیبات گیاهی به دلیل طبیعی بودن و تجزیه پذیری بالا، ‌مشکلات باقی مانده سموم را ندارند. از سوی دیگر اکثر مواد گیاهی به دلیل اختصاصی بودن دارای اثرات کمتر روی دشمنان طبیعی هستند و به دلیل دوام کم، ‌به راحتی به مواد بی خطر تبدیل شده و مشکلات کمتری را به وجود می‌آورند. از این رو در برنامه ‌های کنترل آفات،‌ ترکیبات مشتق شده از گیاهان به عنوان یک منبع زیستی، می ‌توانند جایگزین حشره‌ کش‌ های مصنوعی گردند (Daoubi et al., 2005). استفاده از مشتقات گیاهان،‌ از جمله عصاره ‌های گیاهی به عنوان حشره کش در کشاورزی، به نوعی که امروزه می‌ شناسیم، ‌به حدود چند صد سال پیش بر می‌گردد. تعدادی از منابع گیاهی به صورت تجاری، ‌جهت حفاظت محصولات انباری به کار رفته ‌اند (Thacker, 2002). بسیاری از ترکیبات آللوکمیکال گیاهی نیز، به عنوان ضد تغذیه یا بازدارنده تخم ریزی (Bernays and Chapman, 1994)، دفع کننده، تنظیم کننده رشد و ضد فعالیت (Sadek, 2003; Schmutterer, 1990; Senthil Nathan et al., 2006) شناسایی شده اند.

درچنین شرایطی استفاده از روش‌ های سالم، کم ‌خطر، ‌مؤثر و طبیعی که بتواند در دراز مدت موفقیت ‌آمیز باشند، امری ضروری خواهد بود. در این راستا با توجه به موارد فوق و همچنین بنا به دلایل ذیل، موضوع جایگزینی سموم شیمیایی با نگاه و رویکرد جدید، در مجامع علمی دنیا مورد توجه قرار گرفته است:

1. افزایش سطح آگاهی عمومی در مورد عوارض سوء ناشی از کاربرد سموم شیمیایی (IFOAM, 2002)
2. افزایش سطح تولید و مصرف محصولات ارگانیک (IFOAM, 2002)
3. مشاهده نتایج مؤثر داروهای گیاهی در علم پزشکی و سموم آفتکش غیر سنتزی (عصاره ‌های گیاهان، اسانس ‌های طبیعی یا روغن ‌های فرار، روغن ‌های گیاهی، ‌عوامل بیوکنترل و غیره) در بخش کشاورزی و صنایع غذایی.
4. فشار سازمان ‌ها و آژانس ‌های ناظر بر حفظ کیفیت‌ غذا، محصولات کشاورزی و محیط زیست، جهت محدود کردن استفاده از سموم شیمیایی و جایگزین کردن آن ‌ها با ترکیبات کم خطر (Lafont, 1997)

۱-۴- معرفی ترکیبات گیاهی مورد آزمایش

در پژوهش حاضر، تأثیرات عصاره گل، مراحل مختلف رشدی میوه و برگ گیاه زیتون تلخ، حلال‌ ها و همچنین روش‌ های مختلف و مدرن عصاره گیری روی شته سیاه باقلا مورد ارزیابی قرار گرفت؛ تا بتوان راهی مناسب و روشی جایگزین برای سموم شیمیایی یافت. در ادامه به برخی از خصوصیات گیاه شناسی،‌ مناطق انتشار، ترکیبات مؤثر و خواص دارویی و درمانی این گیاه اشاره می ‌گردد.

۱-۴-۱- خصوصیات گیاه زیتون تلخ

زیتون تلخ با نام علمی Melia azedarach Linnaeus ، با نام ‌های یاس بنفش فارسی (Persian Lilac)، ‌Chinaberry، درخت چتر (Umbrella tree) و سرو سفید (White Cedar) نیز شناخته می‌ شود.

Melia نامی یونانی است و به دلیل شباهت برگ ‌های درخت زیتون تلخ به برگ ‌های درخت زبان گنجشک، به این درخت اشاره دارد. نام اصلی از Meli به معنای عسل آمده است؛ به این دلیل که چندین گونه از زبان گنجشک، ‌شیره‌ی شیرین ترشح می‌کنند. azedarach نامی است که توسط پزشکی ایرانی (احتمالا ابوعلی سینا) به این گیاه داده شده است و اشاره به سمی بودن و آزاد بودن درخت از آفات دارد.

زیتون تلخ بومی استرالیا و جنوب شرق آسیاست؛ ‌در ایران در نواحی شمالی می ‌روید و در بسیاری از نواحی از جمله استان کرمان به عنوان گیاهی زینتی در فضای سبز کاشته می ‌شود (قهرمان، ۱۳۶۵؛ ثابتی، ۱۳۷۳). زیتون تلخ متعلق به خانواده Meliaceae است. این گیاه، ‌درختی خزان کننده با تاجی گرد می باشد. ارتفاع این درخت، در سن بلوغ به ۱۲ متر و پهنای آن به ۸-۶ متر و گاهی در محیط زیست ‌های طبیعی آن به ۳۰ متر می ‌رسد. این گیاه دارای طول عمر متوسط، حدود ۲۰ سال است. گل ها کوچک، با گلبرگ‌ های ۵ تایی ارغوانی کمرنگ و سفید هستند. گل ها اغلب در حال رشد و در خوشه ‌ها دیده می ‌شوند. پرچم ‌ها ‌داخل استوانه ارغوانی تیره به طول ۸-۶ میلی ‌متر، دسته بندی شده ‌اند. میوه ‌های زیتون تلخ گرد،‌گوشت دار، قبل از بلوغ سبز رنگ و در زمان بلوغ به رنگ زرد مشاهده می ‌شوند. درخت زیتون تلخ به دلیل پوشش متراکم اغلب به عنوان درختی سایه دار کاشته می شود (شکل ۵) (Batcher, 2000). گل های معطر زیتون تلخ و میوه ‌های زرد رنگ آن، این درخت را به درختی زینتی و جذاب تبدیل کرده است. دانه ‌های سخت این گیاه همچنین می ‌تواند در هنر و صنایع دستی مورد استفاده قرار گیرد.

شکل ۵: تصاویری از گل، میوه سبز، میوه رسیده و برگ زیتون تلخ Melia azedarach L.

این گیاه نور خورشید را ترجیح می ‌دهد؛ ‌اما در سایه هم می ‌تواند به خوبی رشد کند. به یخبندان مقاوم است و می تواند به مدت طولانی شرایط خشک و بی ‌‌آبی را تحمل کند. همچنین می ‌تواند خود را به طیف گسترده‌ ای از شرایط خاک، وفق دهد. گل های زیتون تلخ در طول بهار و میوه‌‌ ها پس از آن تولید می ‌شوند. این گیاه به راحتی از طریق بذر و قلمه تکثیر می گردد؛ در مدت ۱۰-۶ سال، درخت به مرحله بلوغ می ‌رسد و می‌ تواند دانه تولید کند. دانه ‌های این گیاه برای چندین سال دوام دارند.

این گیاه توانایی قابل توجهی در حشره کشی ‌دارد (Lee et al., 1991; Schmutterer, 1989 and 1995; Valladares et al., 1997). مؤثرترین ماده موجود در ترکیب شیمیایی میوه زیتون تلخ، ‌با عمل مهار کنندگی پوست اندازی، آزادیراختین^[۷] است. آزادیراختین استخراج شده از درخت زیتون تلخ، یک ترپنوئید^[۸] نوع لیمونوئید^[۹] ، با ساختار شبیه اکدیستروئید^[۱۰] می باشد. خاصیت ضد تغذیه ‌ای این ترکیب و تأثیر روی رشد و تولید مثل حشرات به اثبات رسیده است. اگرچه اثرات بیوشیمیایی آن در سطح مولکولی هنوز به خوبی شناخته نشده است (Hoffmann and Lorenz 1998; Reed et al., 1982).

با آزمایشات انجام شده روی موش ‌های آزمایشگاهی مشخص شده است که میوه‌ های زیتون تلخ در صورت مصرف خوراکی و یا تماس با پوست هیچ اثر منفی قابل مشاهده ‌ای روی پستانداران ندارند (Carpinella et al., 2003)؛ این درحالی است که در تحقیقی دیگر گزارش شده است که میوه M. azedarach برای حیوانات خون گرم بسیار سمی است و مصرف ۸-۶ میوه می تواند تهوع، اسپاسم، و در کودکان، حتی مرگ را به دنبال داشته باشد (Orwa et al., 2009).

۱-۴-۲- خواص دارویی و درمانی گیاه زیتون تلخ

در کشور هندوستان، ‌ترشحات این درخت به عنوان ماده ضدعفونی کننده بکار برده می شود. در طب سنتی غرب،‌ گل ‌ها و برگچه ‌های این درخت به طور موضعی، برای درمان سردرد های عصبی استفاده می‌ شوند. خمیر میوه و مرهم گل ‌ها برای از بین بردن شپش، سایر انگل ‌ها و جوش های سر بکار می ‌روند. پوست درخت ضد کرم بوده و در دوز های بالا تهوع آور می ‌باشد. میوه آن با طمعی شبیه ساخارین، ‌برای درمان جذام بکار می ‌رود. با شکستن دانه ‌ها، روغنی بدست می‌آید که علاوه بر خاصیت ضد باروری و ضد انگلی، ‌به عنوان درمان موضعی عفونت های مفصل مفید می ‌باشد (Rair et al., 1988).

۱-۵- معرفی روش ‌های نوین عصاره گیری از ترکیبات گیاهی

روش ‌های سنتی مانند روش عصاره گیری معمولی (سنتی)^[۱۱] و روش‌ سوکسله^[۱۲] که سال ‌ها مورد استفاده قرار می‌گرفته ‌اند، بسیار زمان بر بوده ومقدار زیادی حلال مصرف می‌کنند (Luque de Castro and Garcia-Ayuso, 1998). به همین دلیل تقاضای زیادی برای روش‌ های عصاره گیری جدید با زمان استفاده کوتاه‌تر، ‌میزان مصرف حلال کمتر و اثرات محیط زیستی کمتر وجود دارد. فناوری ‌های جدید و مختلفی شامل عصاره ‌گیری همراه با امواج مایکروویو^[۱۳] (Kaufmann and Christen, 2002) و عصاره گیری با امواج فراصوت^[۱۴] (Vinatoru, 2001) به منظور استخراج ترکیبات از گیاهان گسترش یافته‌ اند. این فناوری ‌ها به منظور، کاهش دادن مدت زمان عصاره گیری، کاهش میزان حلال مصرفی، افزایش بازده استخراج و تقویت کیفیت عصاره حاصله گسترش یافته ‌اند.

۱-۵-۱- عصاره‌گیری به روش استفاده از امواج مایکروویو

استخراج به کمک امواج مایکروویو یکی از انواع استخراج است که بر مبنای گرم شدن یک حلال آلی است. بدین صورت که یک نمونه و حلال مناسب آن در یک ظرف قرار داده می ‌شود. سپس مخلوط بوسیله امواج مایکروویو تحت اثر قرار گرفته و گرم می ‌شود. سپس استخراج به اتمام می ‌رسد و به مخلوط اجازه سرد شدن داده می ‌شود. درآخر مخلوط نمونه گیاهی و حلال فیلتر شده و عصاره بدست می‌ آید. مدت زمان استخراج حدود ۵ تا ۲۰ دقیقه است و بسته به شرایط خاص ۳۰ ثانیه نیز گزارش شده است؛ ‌اما از ۳۰ دقیقه تجاوز نمی کند.

امواج مایکروویو، امواج الکترومغناطیسی با فرکانس ۳/۰ تا ۳۰۰ گیگاهرتز هستند؛ اما مایکروویوهای خانگی و صنعتی معمولا در فرکانس ۴۵/۲ گیگاهرتز کار می کنند (Wang and Weller, 2006). در استخراج با امواج مایکروویو، امواج جذب شده توسط نمونه گیاهی، گرما تولید می کنند؛ که این گرما موجب تبخیر آب نمونه، اعمال فشار روی دیواره سلولی، تخریب دیواره و رهایی ترکیبات درون سلول می گردد (Wang and Weller, 2006; Kaufmann et al., 2001).

دو نوع سامانه تجاری MAE در دسترس می باشد: مایکروویوهای با سیستم محفظه بسته و مایکروویو های متمرکز (Luque-Garcia and Luque de Castro, 2004). استخراج توسط مایکروویوهای با سیستم محفظه بسته، تحت فشار و دمای کنترل شده انجام می شود. در مایکروویوهای متمرکز فقط بخشی از محفظه استخراج که حاوی نمونه است، در معرض تابش امواج مایکروویو قرار می گیرد. از سیستم محفظه بسته برای استخراج تحت شرایط شدید مانند استخراج در دماهای بالا استفاده می شود. اصولا فشار در محفظه به حجم و نقطه جوش حلال ها بستگی دارد.

دما و اندازه ذرات در این روش اهمیت زیادی دارد. به علاوه در این روش، محتوای رطوبت ماده گیاهی بسیار مهم است، زیرا حلال­ های قطبی و به ویژه آب توانایی جذب امواج را خواهند داشت. بنابراین هر چه محتوای رطوبت ماده بیشتر و میزان جذب امواج بیشتر باشد، گرمای بیشتری ایجاد شده و در نتیجه تخریب سلول­ ها نیز افزایش می­ یابد.

۱-۵-۲- عصاره‌گیری به روش استفاده از امواج فراصوت

استخراج به کمک امواج فراصوت یکی از مهم ‌ترین روش‌ های استحصال ترکیبات ارزشمند از منابع گیاهی است (Vilkhu et al., 2008). در مقایسه با سایر روش‌ های استخراج از جمله استخراج بر پایه مایکروویو، استفاده از امواج فراصوت ارزان‌ تر بوده و کاربرد آن‌ ساده‌تر است (Chen et al., 2008). سامانه ‌هایی که با این امواج کار می کنند، به دو صورت حمام و میله^[۱۵] هستند که در مقیاس آزمایشگاهی و صنعتی قابل استفاده می ‌باشند (Wu et al., 2001; Vinatoru, 2001). در این روش امواج فراصوت با فرکانس بالاتر از ۲۰ کیلوهرتز، به داخل ماده گیاهی نفوذ کرده و موجب ایجاد کشیدگی ­ها و جمع شدن ­های پی­ در ­پی می شود؛ که در نتیجه آن حفراتی داخل ماده ایجاد می­ گردد. این حفرات به صورت نامتقارن به هم پیوسته و موجب خروج سریع مواد از داخل سلول ­ها به خارج از آن می ‏شوند. به علاوه این امواج می­ توانند موجب تخریب دیواره سلول­ های زیستی شده و خروج مواد را تسهیل کنند (Luque-Garcia and Luque de Castro, 2003).

در این روش محتوای رطوبت ماده گیاهی اهمیت فراوانی دارد؛ زیرا حداکثر قدرت امواج در مجاورت منبع تولید موج بوده و با افزایش فاصله از منبع، قدرت امواج کاهش می ­یابد؛ به علاوه هر چه ماده موجود در مسیر تابش جامد و متراکم­ تر باشد، میزان کاهش امواج بیشتر خواهد بود. بنابراین با بکار بردن ماده گیاهی مرطوب (ماده گیاهی+حلال) از کاهش قدرت امواج جلوگیری می ­شود. کاهش اندازه ذرات نیز در این روش موجب افزایش بازده می­گردد. دمای عصاره­گیری در این روش باید مد­نظر قرار گرفته شود و از افزایش بیهوده دما جلوگیری گردد. طول مدت عصاره­گیری نیز در این روش اهمیت خاصی داشته و افزایش بیش از حد آن موجب تغییر در کیفیت عصاره حاصله خواهد شد (Salisova et al., 1997).

مکانیسم اصلی استخراج با امواج فراصوت به پدیده کاویتاسیون^[۱۶] (حفره حفره شدن) مربوط می شود، که طی آن حباب های بسیار ریزی در توده مایع تشکیل شده و به سرعت تا یک اندازه بحرانی رشد می‌کنند و سپس منفجر می‌گردند. انفجار این حباب ‌ها اغلب با آزاد شدن مقدار زیادی انرژی همراه است؛ که به شکل تنش برشی به محیط اطراف اعمال می ‌شود (Ji et al., 2006). افزون بر این، انفجار حباب‌ ها باعث ایجاد اغتشاشات شدید موضعی و تلاطم‌ های گرداب گونه شده که از این طریق انتقال جرم را افزایش می دهد. شایان ذکر است که مطالعات انجام شده توسط محققان مختلف مشخص ساخته است که انفجار حباب ‌ها در مجاورت ذرات جامد نامتقارن می ‌باشد؛ به طوری که موجب می ‌شود جریانی از مایع با سرعت بسیار زیاد به سمت سطح ذرات کشیده شود. اصابت این میکروجت‌ ها^[۱۷] به سطح باعث سایش،‌ شکستگی و تخریب آن می‌گردد (Shotipruk et al., 2001). امواج فراصوت، مراحل فرایند استخراج یعنی تورم بافت به منظور جذب حلال و نیز خروج ترکیبات از بافت به حلال را از طریق ایجاد تخلخل و منافذ در دیواره سلول ‌ها و بهبود انتشار و انتقال جرم تسهیل و تسریع می‌کنند (Vinatoru, 2001). از این رو استفاده از این امواج در استخراج ترکیبات مختلف از بافت ‌های گیاهی، راندمان عمل و سرعت فرایند استخراج را افزایش داده و مصرف حلال را کاهش می دهد (Vilkhu et al., 2008). در همین رابطه گزارش شده که استخراج روغن از دانه کلزا با کمک امواج فراصوت با سرعت بیشتری صورت می گیرد. از سوی دیگر مشخص شده که نوع حلال راندمان استخراج با امواج فراصوت را تحت تأثیر قرار می ‌دهد (Stanisavljevic et al., 2007).

۱-۶- اهداف پژوهش

ترویج کاهش مصرف سموم در مدیریت کنترل آفات با بهره گرفتن از حشره کش های گیاهی در مبارزه تلفیقی آفات.

بررسی خواص حشره کشی عصاره ‌گیاهی زیتون تلخ تهیه شده با حلال ‌های مختلف قطبی، حد واسط و یا غیر قطبی، بر روی شته سیاه باقلا.

بررسی تأثیرگذاری نوع حلال مورد استفاده جهت استخراج عصاره‌ زیتون تلخ، در میزان اثر حشره کشی آن ‌ها.

بررسی تأثیر روش ‌های نوین عصاره گیری از ترکیبات گیاهی، در قدرت حشره‌کشی عصاره زیتون تلخ.

بررسی اثرات زیر کشندگی عصاره زیتون تلخ بر روی پوره زایی ماده های بالغ (حشرات تازه بالغ شده) شته سیاه باقلا.

مقایسه اثرات حشره کشی بخش های مختلف گیاه زیتون تلخ.

فصل دوم

مروری بر منابع

و بررسی مطالعات انجام شده

۲-۱- بررسی اثرات متفاوت عصاره گیاه زیتون تلخ روی حشرات

استفاده از گیاهان حشره کش‌ از سال ۱۸۵۰ با سموم گیاهی، مانند نیکوتین و روتنون آغاز گردیده و تاکنون نتایج بسیار خوبی از نحوه کنترل آفات با ترکیبات گیاهی بدست آمده است (Chaubey, 2007). برخی از گیاهان از ترکیباتی تشکیل شده ‌اند که این ترکیبات می‌ توانند حشرات آفات را از محصولات گیاهی دور کنند و خسارت اقتصادی آن ‌ها را کاهش دهند. برای مثال گیاه سیر^[۱۸]، آفاتی مانند سوسک ژاپنی، شته ‌ها،‌ سرخرطومی ‌های سبزیجات و کنه ‌های تارتن عنکبوتی را دور می‌کند (Zehnder, 2004). در گذشته برگ‌ های درخت عرعر^[۱۹] و تمام اندام ‌های گیاه سریشک^[۲۰] علیه شته ‌ها مورد استفاده قرار می‌گرفت (Pascual-Villalobos and Robledo, 1999).

مشتقات درخت زیتون تلخ به عنوان حشره کش تشخیص داده شده است. میوه ‌های این گیاه، باعث تأخیر در رشد، ‌کاهش باروری، نقص‌ های مورفولوژیکی و تغییرات رفتاری در حشرات می ‌شود (Senthil Nathan and Sehoon, 2006). از عصاره درخت زیتون تلخ به عنوان یک ترکیب ضد تغذیه، ‌دور کننده و تنظیم کننده رشد در حشرات استفاده شده است (Reed et al.,1982).

در پژوهشی، اثر عصاره‌ های متانولی Azadirachta indica و Melia azedarach روی تخم ‌ریزی و تفریخ تخم ‌های پروانه Earias vittella F. مورد ارزیابی قرار گرفتند (Gajmer et al., 2002). در مطالعه ‌ای دیگر بررسی تأثیر حشره کشی‌ عصاره آبی برگ و میوه رسیده زیتون تلخ روی مرحله پورگی سفید بالک گلخانه^[۲۱] صورت گرفت (Jazzar and Abou-Fakhar, 2003). همچنین تأثیر عصاره اتانولی دانه زیتون تلخ روی شته جالیز^[۲۲] و شته سبز هلو^[۲۳] بررسی شد (سالاری و همکاران ،a 1390).

در مطالعه ای آزمایشگاهی، تأثیر عصاره آبی زیتون تلخ بر روی فعالیت ‌های زیستی لارو پروانه Spodoptera frugiperda بررسی شد (Carvalho and Ferreira, 1990). همچنین اثرات ضد تغذیه ‌ایی عصاره آبی گل، میوه، ساقه و برگ گیاه زیتون تلخ روی Diabrotca speciosa بررسی گردید (Ventura and Ito, 2000). در تحقیقی دیگر، اثرات دورکنندگی و ضد تغذیه ایی برگ، میوه رسیده و میوه نارس زیتون تلخ روی سفید بالک گلخانه گزارش شده است (Abou Fakhr et al., 2001; Nardo et al., 1997). دز زیرکشنده عصاره میوه رسیده زیتون تلخ نیز توسط دفاگو^[۲۴] و همکاران (۲۰۰۹) بررسی شده است. به علاوه گزارش شده است که عصاره برگ زیتون تلخ، در بقای لارو و حشرات بالغ Epilachna paenulata تأثیر دارد (Kraus et al., 1986). در تحقیقی دیگر، تأثیر عصاره برگ زیتون تلخ، روی رشد و دگردیسی E. varivesti بررسی شد (Zhu and Ermel, 1991). تأثیر عصاره بدست آمده از برگ و میوه نارس زیتون تلخ روی مرگ و میر حشرات بالغ سفید بالک گلخانه به اثبات رسیده است (Nardo et al., 1997).

دهقانی و احمدی (۱۳۹۰) تأثیر عصاره متانولی زیتون تلخ روی مراحل مختلف زیستی سفید بالک گلخانه^[۲۵] را‌، در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار دادند. اثرات حشره‌کشی دو عصاره گیاهی، شامل دانه گیاه زیتون تلخ و اسفند روی تریپس پیاز^[۲۶]، در شرایط آزمایشگاه توسط نجمی ‌زاده و احمدی (۱۳۹۰) مورد مطالعه قرار گرفته است. در پژوهشی دیگر، اثر عصاره اتانولی گیاه زیتون تلخ روی تغذیه لارو و حشره کامل سوسک برگخوار نارون Xanthogalleraca luteola Mulle (Coleoptera: Chrysomelidae) بررسی شد (Valladares et al., 1997).

انواع گوناگونی از عصاره های خام بخش های متفاوت گیاه زیتون تلخ از جمله عصاره برگ و میوه رسیده آن، برای ارزیابی فعالیت های ضدتغذیه ایی برخی حشرات شامل راسته های Saltatoria، Heteroptera، Homoptera، Coleoptera، Lepidoptera و Diptera استفاده شده است (Ascher et al., 1995). عصاره برگ زیتون تلخ همچنین، تخم ریزی پشه Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) را کاهش داد (Defago et al., 2009)؛ این در حالی است که در تحقیقی دیگر، مشخص شد که عصاره میوه رسیده زیتون تلخ، اثری روی تخم گذاری پشه A. aegypti ندارد (Coria et al., 2008). همچنین اثرات قوی ضد تخم گذاری عصاره زیتون تلخ، روی ماده های Anopheles stephensi گزارش شده است (Senthil Nathan et al., 2006)؛ اگرچه در این تحقیق اثر عصاره میوه رسیده زیتون تلخ به مراتب بیشتر از عصاره برگ بود.

دفاگو و همکاران (۲۰۰۹) نشان دادند که عصاره زیتون تلخ روی تخم ریزی E. paenulata تأثیر دارد. در پژوهشی دیگر، اثر عصاره برگ زیتون تلخ روی مرگ و میر، طول دوران لاروی و سرعت رشد Spodoptera frugiperda بررسی شد (De Brito et al., 2004; McMillian et al., 1969). تأثیر عصاره های قسمت های مختلف رشدی زیتون تلخ شامل میوه نارس و رسیده، برگ و ساقه، روی مرگ و میر سفید بالک به اثبات رسیده است (De Souza and Vendramin, 2001). همچنین گزارش شده است که عصاره آبی میوه رسیده زیتون تلخ، روی گونه های مختلف شته ها تأثیر دارد (Defago et al., 2009).

همچنین فعالیت ضد تغذیه ای آزادیراختین استخراج شده از دانه های زیتون تلخ علیه لارو Spodoptera exiguae به اثبات رسیده است (Huang et al., 1995). بررسی تأثیر عصاره اتانولی گیاه زیتون تلخ بر روی آفت سرخرطومی برنجL. Sitophilus oryzae نیز بیانگر خاصیت حشره کشی این عصاره گیاهی در ارتباط با این آفت است (Panji, 1946). اثرات عصاره اتانولی زیتون تلخ روی لارو شب پره Pieris brassicae و سوسک Aulacophora foveicollis بررسی گردید (Saljoqi et al., 2006). مطالعات نشان داد که عصاره اتانولی زیتون تلخ برای کنترل لارو سن سوم و چهارم Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) تأثیر بسزایی دارد (Prophiro et al., 2008). همچنین خبیر و همکاران (۱۳۹۳) گل درخت زیتون تلخ را به عنوان شته کش معرفی کرده و تأثیر غلظت های مختلف عصاره اتانولی آن را روی مرگ و میر حشرات بالغ شته سیاه باقلا مورد بررسی قرار دادند.

۲-۲- بررسی اثرات حلال های مختلف روی حشرات

در امر استخراج ترکیبات مؤثر موجود در یک عصاره گیاهی، نوع حلالِ مورد استفاده جهت استخراج عصاره، در میزان اثر حشره کشی آن عصاره گیاهی نقش دارد. در یک تحقیق، تأثیر نوع حلال و تکنیک عصاره گیری،‌ بر روی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره برخی گیاهان دارویی بررسی شد (Sultana et al., 2009). در آزمایشی دیگر، جهت تعیین تأثیر نوع حلال بکار رفته در تهیه عصاره دانه گیاه زیتون تلخ، ‌روی خاصیت حشره کشی عصاره ‌های استخراج شده، بر روی شته سیاه باقلا مورد بررسی قرار گرفت (سالاری و همکاران، b1390).

۲-۳- استخراج از گیاهان به کمک روش های نوین استخراج

در پژوهشی با کمک امواج مایکروویو، استخراج ترپن ها از دانه های زیره انجام شد (Chemat et al., 2005). استخراج پلی فنول ها^[۲۷] از پوست پرتقال^[۲۸] با کمک امواج فراصوت صورت گرفت و استخراج طی مدت زمان ۳۰ دقیقه انجام شد (Kamran Khan, 2010). کاربرد فراصوت در تکنولوژی مواد غذایی (پردازش، حفظ و استخراج) توسط چمت^[۲۹] و همکاران (۲۰۱۱) بررسی شد. همچنین روش های متداول و جدید در زمینه استخراج مواد غذایی از گیاهان، از جمله استخراج سوکسله، استخراج با کمک امواج مایکروویو و استخراج با کمک امواج فراصوت مورد بررسی قرار گرفته اند (Wang and Weller, 2006).

در آزمایشی اثر روش های مختلف استخراج بر راندمان استخراج روغن از پوست درخت Pinus radiata، مورد مطالعه قرار گرفت (Aspe and Fernandez, 2011). استخراج روغن از دانه های کتان با کمک امواج فراصوت نیز، توسط زانگ^[۳۰] و همکاران (۲۰۰۸) انجام پذیرفت.

فصل سوم

مواد و روش ها

۳-۱-کشت گیاه میزبان

پس از زهکشی گلدان‌ های پلاستیکی (با قطر ۱۰ سانتی‌ متر) با سنگ ‌ریزه، ‌این گلدان ‌ها با مخلوطی از ماسه بادی و کود گیاهی پوسیده (خاک برگ) پر شدند. سپس درون هر گلدان (با توجه به اندازه بذر ها و حجم‌ گلدان)، چند بذر باقلا کاشته و همواره سعی شد که عمق مناسب کاشت رعایت گردد. به منظور جلوگیری از آلودگی گیاهان مذکور به آفاتی نظیر کنه ‌ها، ‌تریپس ‌ها و یا شته‌ ها، گلدان ‌های باقلا پس از کشت، ‌در داخل قفس ‌های چوبی یا فلزی با ابعاد ۸۰×۶۰×۶۰ سانتی‌ متر که با تور ارگانزا و یا حریر پوشیده شده بودند، ‌درون گلخانه در شرایط دمایی ۵±۲۵ درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی ۱۰±۶۰ درصد و ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار داده شدند (شکل ۶). هر دو روز یکبار،‌ گلدان ‌ها آبیاری شده و زمانی که به مرحله چند برگی رسیدند (تقریباً پس از ۲ هفته)، برگ ‌های این گیاهان در آزمایشات استفاده گردید. لازم به ذکر است که در طول آزمایشات، ‌به طور متناوب،‌ تعدادی گلدان از گیاه باقلا کاشته شد (شکل ۷).

شکل ۶: تصویری از قفس ‌نگهداری گلدان ها در گلخانه (اصلی- Original)

شکل ۷: گیاهان باقلای کشت شده در گلخانه، جهت استفاده در آزمایشات (اصلی- Original)

۳-۲- پرورش حشرات

جهت بررسی تأثیر عصاره گیاهی،‌ حلال‌ های متفاوت و روش ‌های نوین استخراج عصاره از مراحل مختلف رشدی گیاه زیتون تلخ ‌در کنترل حشرات، از شته سیاه باقلا استفاده شد. به منظور پرورش آزمایشگاهی، شته مذکور، ‌از روی گیاهان میزبان در شهرستان کرمان جمع‌ آوری گردید. پس از انتقال شته ‌ها به آزمایشگاه و شناسایی آن ‌ها، یک کلنی از این شته پرورش داده شد. شته‌ ها درون ظروف مخصوص پرورش (ظروف پلاستیکی به قطر ۶ سانتی‌ متر و ارتفاع ۴ سانتی‌ متر، حاوی ژل آگار۷/۰ درصد)، برروی برگ ‌های باقلا پرورش داده شدند.

جهت تهیه ژل آگار ۷/۰ درصد، مقدار ۷ گرم از پودر آگار را داخل ۱۰۰۰ میلی‌ لیتر آب حل کرده و سپس این محلول به طور یکنواخت حرارت داده شد. پس از جوش آمدن و روشن ‌تر شدن رنگ محلول، محلول به میزان معین درون ظروف پرورش ریخته شد. پس از گذشت مدت زمان ۲۰ الی ۳۰ دقیقه، محلول درون ظروف پرورش به صورت ژل در آمده و قابل استفاده جهت پرورش حشرات و انجام آزمایشات شد. از محیط آگار ژل جهت حفظ رطوبت و نگهداری برگ‌ های گیاه میزبان برای مدت زمان طولانی تر استفاده گردید. داخل همه ظروف به طور معمول تعداد ۱۰ تا ۱۵ عدد شته بالغ جهت پرورش انبوه کلنی قرار داده و درب ظروف با توری های مخصوص (حریر شیشه‌ای برش خورده)، جهت تبادل هوا پوشانده شد. سپس ظروف پرورش در داخل اتاقک رشد^[۳۱] (شکل ۸)،‌ در شرایط دمایی ۱±۲۵ درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی ۱۰±۵۰ درصد و ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. درون اتاقک رشد جهت کنترل دقیق ‌تر تغییرات محیطی، از دستگاه رطوبت سنج (هیدرومتر) و دماسنج ماکزیمم-مینیمم استفاد شد. با پوره زایی شته ‌ها و افزایش جمعیت، ‌تعدادی از بالغین به ظروف پرورش جدید حاوی ژل آگار و برگ ‌های جدید گیاه‌ میزبان منتقل گردید (شکل ۹).

شکل ۸: اتاقک رشد و ظروف پرورش حشرات داخل آن (اصلی- Original)

شکل ۹: ظروف مخصوص پرورش شته سیاه باقلا (اصلی- Original)

برای بدست آوردن شته ‌های همسن، تعداد ۲۰۰ عدد شته بالغ از کلنی اولیه جدا و در یک کلنی جداگانه نگهداری گردیدند. پس از۲۴ ساعت، حشرات بالغ جدا شده و به کلنی اصلی بازگردانده شدند. در این حالت پوره ‌های ایجاد شده، یک یا دو روزه بوده که جهت انجام برخی از آزمایشات استفاده شدند (شکل ۱۰).

شکل ۱۰: پوره ۲-۱ روزه شته سیاه باقلا (اصلی- Original)

جهت آماده سازی پوره ‌های ۳ یا ۴ روزه، پوره‌ های یک یا دو روزه در کلنی جداگانه ‌ایی نگهداری شده و پس از ۴۸ ساعت، پوره ‌ها به سن سه یا چهار روزه رسیده و برای انجام آزمایشات مربوطه مورد استفاده قرار گرفتند (شکل ۱۱).

شکل ۱۱: پوره ۴-۳ روزه شته سیاه باقلا (اصلی-Original)

همچنین جهت آماده سازی بیوتست^[۳۲]، برای بررسی میزان پوره زایی ماده‌ های بالغ شته سیاه باقلا، ‌پوره ‌های ۲-۱ روزه درکلنی دیگری نگهداری شده،‌ پس از حدود ۷ روزه پوره‌ ها بالغ شده و سپس حشرات ‌تازه بالغ شده به محیط آزمایش منتقل شدند (شکل ۱۲).

شکل ۱۲: حشره تازه بالغ شده شته سیاه باقلا (اصلی-Original)

۳-۳- تهیه نمونه ‌های گیاهی

از زمستان ۱۳۹۱ تا اواخر پائیز ۱۳۹۲، ‌با توجه به نیاز، ‌مراحل متفاوت رشدی گیاه زیتون تلخ،‌ شامل گل، ‌میوه سبز کوچک (به قطر متوسط ۳ میلی متر)، میوه سبز بزرگ (به قطر متوسط ۷ میلی متر)، میوه رسیده و برگ، جهت انجام آزمایشات از رویشگاه طبیعی آن در منطقه ماهان (۵۷ درجه و ۹ دقیقه و ۳۰ ثانیه شرقی و ۳۰ درجه و۹ دقیقه و ۷۰ ثانیه شمالی، ارتفاع از سطح دریا ۱۷۹۴ متر) جمع آوری شدند.

نمونه های گیاهی پس از انتقال به آزمایشگاه، در شرایط مناسب (سایه و تهویه) خشک شدند. یک هفته پس از خشک شدن کامل اندام‌ های گیاهی، این قسمت ‌ها توسط آسیاب برقی استیل به مدت ۳ دقیقه کاملا پودر شدند. چون ماده مؤثر موجود در عصاره گیاه ممکن است قطبی، حد واسط و یا غیر قطبی باشد، جهت انجام آزمایشات از حلال ‌های قطبی (‌آب مقطرآزمایشگاهی، اتانول و متانول)، حلال حد واسط (‌استون) و حلال غیر قطبی (اِن هگزان) با درجه خلوص ‌های ۹۵ تا ۹/۹۹ درصد جهت عصاره گیری استفاده شد. همچنین به منظور بررسی تأثیر روش‌ های مختلف عصاره گیری از سه روش عصاره گیری به روش معمول و متداول (سنتی)، عصاره‌گیری با امواج مایکروویو و عصاره‌گیری با امواج فراصوت استفاده گردید.

۳-۴- تهیه عصاره ‌های گیاهی به روش عصاره‌گیری معمولی (سنتی)

در هر مرحله از عصاره گیری ۷۰ گرم از اندا‌م‌ های گیاهی پودر شده در ارلنی به حجم ۵۰۰ میلی‌ لیتر ریخته شد. با توجه به هدف و نوع آزمایش روی هرکدام از آن‌ ها به صورت مجزا از حلال‌ های فوق الذکر ریخته تا حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی ‌لیتر رسید. پس از یک ساعت همزدن در زیر هود، درب ارلن با پارافیلم به خوبی بسته شد تا حلال از ظرف خارج نگردد. به منظور جلوگیری از تابش مستقیم نور به ارلن، دور آن با فویل آلومینیوم پوشانده شد. سپس مخلوط عصاره و باقی مانده گیاهی به مدت ۲۴ ساعت در یخچال (دمای ۴ درجه سانتی‌گراد)‌ نگهداری گردید.

پس از ۲۴ ساعت، عصاره گیاهی توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ از باقی ‌مانده‌ گیاهی جدا شد. در مراحل بعدی جهت انجام آزمایشات، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی ‌لیتر از عصاره ‌های فوق آماده سازی شده و مورد استفاده قرار گرفت (شکل ۱۳).

شکل ۱۳: یک نمونه از عصاره های استخراج شده به روش استخراج معمولی (اصلی-Original)

۳-۵- تهیه عصاره‌ های گیاهی به روش عصاره‌گیری با امواج مایکروویو

به منظور عصاره‌گیری از مراحل مختلف رشدی گیاه زیتون‌ تلخ با کمک امواج مایکروویو،‌ از آب مقطر به عنوان واسطه پراکندگی استفاده شد. زیرا نقطه جوش حلال ‌های دیگر که در بالا ذکر شد، نسبت به آب پایین‌ تر بوده و به سرعت در مایکروویو به جوش آمده و موجب ایجاد آتش سوزی می ‌شوند. جهت عصاره‌گیری، ‌۷۰ گرم از هرکدام از مراحل رشدی زیتون تلخ (گل، میوه‌ سبز کوچک، میوه سبز بزرگ، میوه رسیده و برگ) که کاملا پودر شده بودند،‌ درون ارلنی به حجم ۵۰۰ میلی ‌لیتر ریخته شد. سپس به آن ‌ها آب مقطر اضافه گردید تا حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی‌ لیتر رسید. سپس هر ارلن‌ به طور جداگانه‌ درون مایکروویو قرار گرفت. هرکدام از مراحل گیاهی به صورت جداگانه، در مدت زمان های ۳۰ و ۵۰ ثانیه در معرض امواج مایکروویو قرار گرفتند. پس از عصاره‌گیری در مدت زمان ‌های ذکر شده،‌ مخلوط توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ فیلتر شد. جهت انجام آزمایشات، از هر کدام از عصاره‌ ها، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر تهیه گردید. همچنین مقدار ۵۰ میلی‌ لیتر آب مقطر، به مدت ۳۰ و۵۰ ثانیه درون مایکروویو (به منظور استفاده در شاهد) قرار داده شد. در این روش از مایکروویو مدل ۲۳۵۰ Samsung MW با فرکانس امواجی معادل ۲۴۵۰ مگاهرتز استفاده گردید (‌شکل ۱۴).

شکل ۱۴: دستگاه استفاده شده در استخراج عصاره با کمک امواج مایکروویو (اصلی-Original)

۳-۶- تهیه عصاره ‌های گیاهی به روش عصاره‌گیری با امواج فراصوت

جهت انجام این مرحله، از اتانول ۹۶ درصد به عنوان واسطه پراکندگی استفاده شد. بدین منظور، ۷۰ گرم از هرکدام از مراحل گیاهی که کاملا پودر شده بودند، درون بشری به حجم ۵۰۰ میلی ‌لیتر ریخته و با اضافه کردن اتانول حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی ‌لیتر رسید. سپس بشر حاوی مخلوط ماده گیاهی و حلال، ‌درون دستگاه اولتراسونیک قرار گرفت. عصاره‌گیری باید به مدت ۳۰ دقیقه تحت امواج فراصوت (به موج ‌های صوتی که فرکانس نوسان آن ها بیش از محدوده شنوایی انسان یا ۲۰‏ سیکل^[۳۳] در ثانیه ‎‏باشد، فراصوت گفته می‌شود) انجام می گرفت؛ به دلیل احتمال آسیب‌ دیدن میله^[۳۴] دستگاه اولتراسونیک، بعد از هر ۲ دقیقه امواج دهی، یک دقیقه به دستگاه استراحت داده می ‌شد. بنابراین برای آماده سازی هر عصاره، ۴۵ دقیقه زمان لازم بود. پس از این مدت زمان، ‌بلافاصله عصاره‌ گیاهی توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ از باقی مانده‌گیاهی جدا شد. در مراحل بعدی از هر عصاره، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر تهیه گردیده و در آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت. همچنین دامنه نوسان^[۳۵] و سیکل دستگاه التراسونیک در این آزمایش، به ترتیب روی ۸۰ و ۶/۰ تنظیم شد. شدت موج متناسب با مربع دامنه نوسان در آن نقطه است. ارتعاش منبع، ذرات مجاور را به نوسان در می ­آورد و این ذرات نیز ذرات مجاور خود را مرتعش می ­سازند و ارتعاش ماده زنجیروار ادامه یافته و پیش می ­رود. انتقال این ارتعاشات از ذره­ای به ذره دیگر در واقع همان موج صوتی است که در محیط منتشر می ­شود.

جهت عصاره‌گیری به روش استفاده از امواج فراصوت، از دستگاه Ultrasound Technology، مدل UP200s، ساخت شرکت hielscher آلمان استفاده گردید (شکل ۱۵).

شکل ۱۵: دستگاه استفاده شده در استخراج عصاره با کمک امواج فراصوت (اصلی-Original)

۳-۷- آزمایشات زیست سنجی

۳-۷-۱- بررسی اثر حشره کشی عصاره ‌های گیاهی استحصال شده با روش های عصاره‌گیری مختلف روی پوره‌ های یک یا دو روزه و سه یا چهار روزه شته سیاه باقلا

اثرات کشندگی عصاره های گل، مراحل مختلف رشدی میوه و برگ گیاه زیتون تلخ،‌ روی پوره ‌های یک یا دو روزه و سه یا چهار روزه شته سیاه باقلا مورد بررسی قرار گرفت. به منظور تعیین تأثیر نوع حلال مورد استفاده در میزان قدرت حشره‌کشی مراحل مختلف رشدی گیاه زیتون تلخ، از عصاره ‌های آبی،‌ اتانولی،‌ متانولی، استونی و اِن هگزانی استفاده شد. همچنین جهت تعیین تأثیر روش های متفاوت عصاره‌گیری، در میزان استخراج عصاره‌ و قدرت حشره‌کشی این روش ها،‌ از سه روش عصاره‌گیری ‌شامل، عصاره‌گیری معمولی (سنتی)، عصاره‌گیری با کمک امواج مایکروویو و عصاره‌گیری با کمک امواج فراصوت استفاده گردید.

هر واحد آزمایشی شامل یک پتری دیش پلاستیکی به قطر ۶ سانتی ‌متر، محتوی ژل آگار ۷/۰ درصد، به ضخامت یک سانتی ‌متر بود که بر روی آن یک برگ تازه باقلا قرار داشت. شته ‌های مربوط به هر آزمایش، ‌روی برگ‌ های باقلا مستقر شدند (در هر واحد آزمایشی،‌۲۰ عدد پوره‌ با سن مشخص قرار داده شد). برای هرآزمایش، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی ‌لیتر از هریک از عصاره ‌های فوق آماده گردید. همچ