۱
۱۰
۵/۶

*Forward **Backward ***Master Mix
۳-۶-۲ مراحل PCR
قبل از انجام پی­ سی ­آر، آغازگرها با توجه به دستور العمل شرکت سازنده آن‌ها با میزان آب مقطر مشخص شده بر حسب میکرولیتر رقیق شدند تا غلظت آن‌ها به ۱۰۰ پیکومول برسد. سپس به مدت ۲۴ ساعت در شرایط یخچال نگهداری شدند تا کاملا حل شوند. سپس تیوب‌های مورد استفاده بعد از استریل کردن، شماره خورده و به منظور جلوگیری از پاک شدن شماره‌ها برچسب نصب شدند. تمام اجزای واکنش (به غیر از DNA که در تیوپ‌های جداگانه ریخته شدند) با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده برای پی ­سی ­آر به صورت مخلوط در تیوب­ جدا گانه ریخته شدند. لازم به ذکر است که در تهیه مخلوط اصلی^[۵۵] واکنش، با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده در پی­ سی ­آر یک ضریب خطا در نظر گرفته شد. بعد از تهیه مخلوط اصلی، مقدار ۵/۱۸ میکرولیتر از آن، به هر یک از تیوپ‌های حاوی ۵/۱ میکرو لیتر DNA افزوده شده تا حجم کل مخلوط واکنش در هر تیوب به ۲۰ میکرو لیتر برسد. به منظور مخلوط شدن اجزای تشکیل دهنده واکنش، تیوب‌ها به مدت ۱۵ ثانیه و با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. بعد از سانتریفوژ تیوپ‌ها برای انجام پی ­سی ­آر در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شدند.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

شکل ۳-۲ دستگاه ترموسایکلر
۳-۶-۳ تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR
همانند سازی و تکثیر توالی مورد نظر در پی­ سی ­آر در طی سه مرحله انجام می‌پذیرد:
۳-۶-۳-۱ واسرشته سازی قطعه الگو
پیوندهای هیدروژنی که در واقع اتصال دهنده دو رشته DNA هستند در دمای ۹۵-۹۳ درجه سانتی‌گراد تخریب می‌شوند بنابراین در این حرارت دو رشته DNA الگو از هم جدا می‌شوند. پس از تک رشته‌ای شدن DNA الگو، آغازگر و سایر مواد شرکت کننده در واکنش، فعالیت خود را آغاز می‌کنند.
۳-۶-۳-۲ اتصال آغازگرها:
در این مرحله آغازگرها به رشته DNA الگو می‌چسبند. دمای اتصال با توجه به دمای ذوب آغازگرها تنظیم می‌شود که معمولا بین ۵۰ تا ۶۵ درجه سانتی ­گراد می‌باشد. آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش برای ژن هورمون رشد در بر گیرنده قسمتی از اگزون ۴ و اینترون ۴ و اگزون ۵ به طور کامل هستند (گروس و همکاران،۱۹۹۶).
جدول ۳-۳ توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GH

منبع

نام جایگاه

توالی

نوع پرایمر

گروس و همکاران
،۱۹۹۶

GH

۵’-GGAAGCTTAACCCCAACCAGCTCACTGAGAA-3′

رفت

۵’-CTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAG-3′

برگشت

۳-۶-۳-۳ بسط (طویل سازی) آغازگرها:
بهترین دما برای بسط آغازگرها دمای ۷۲ درجه سانتی ­گراد می‌باشد. بسط آغازگرها با حضور آنزیم دیانای پلیمراز مقاوم به حرارت انجام می‌شود. در PCR تعداد چرخه‌ها بین ۲۸ تا ۴۰ چرخه انتخاب می‌شوند. دماها و زمان‌های استفاده شده و تعداد سیکل‌های پی سی آر برای هر نشانگر در جدول ۳-۴ آورده شده است.
جدول ۳-۴ دماهای استفاده شده در سیکل‌های PCR (درجه سانتی‌گراد)

نام نشانگر

واسرشته (C˚))

اتصال آغازگر (C˚(

بسط آغازین (C˚(

بسط نهایی (C˚(