۳-۱۳- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید
برای همسانه‌سازی[۲۲] محصول پی‌سی‌آر تکثیر شده با آغازگرهای PMH1RTPF و PMH1RTPR از کیت InsTACloneTM PCR Product cloning شرکت Fermentase استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۱۳-۱- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی
جهت الحاق محصول پی‏سی‏آر در ناقل pTZ57R/T (شکل ۳-۳) مواد لازم به مقادیر ذکر شده در جدول (۳-۱۱) در یک میکروتیوب ml5/0 ریخته و به خوبی با هم مخلوط شدند سپس میکروتیوب برای مدت یک شب در دمای C° ۲۲ قرار داده شد.
شکل ۳-۳- ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T.
جدول ۳-۱۱- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش اتصال.

میزان مصرف

اجزای واکنش اتصال

۵/۱ میکرولیتر

pTZ57R/T ناقل پلاسمیدی

۳ میکرولیتر

محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

۳ میکرولیتر

بافر اتصال ( X۵)

۵/۰ میکرولیتر

آنزیم T4 لیگاز u/µl) 5 (

۷ میکرولیتر

آب مقطر استریل

۱۵ میکرولیتر

حجم کل

۳-۱۳-۲- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α
طبق دستورالعمل کیت همسانه سازی برای انتقال پلاسمید به باکتری به طریق زیر عمل شد:
۱- به ازای هر نمونه ۱۰۰ میکرولیتر از باکتری کشت داده شد و ۷۵۰ میکرولیتر از محیط کشت C-medium که قبلا به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شده بود با هم مخلوط شد و برای مدت ۳ تا ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در یک فالکون روی شیکر قرار داده شد تا مخلوط شوند.
۲- به میزان۱۱۰ میکرولیتر از محلول TA و ۱۱۰ میکرولیتر از محلول TB با هم مخلوط شده و روی یخ قرار داده شد.
۳- به میزان ۸۵۰ میکرولیتر از باکتری و محیط C-medium که روی شیکر قرار داشت به یک تیوب ۵/۱ میکرولیتری منتقل و برای مدت ۱ دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد.
۴- محلول رویی حذف شده و ۱۵۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) به محلول مرحله ۳ اضافه و به ‌خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۵- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۶- تیوب‌ها برای مدت ۱ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ شدند.
۵- محلول رویی حذف شد و به رسوب ۶۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) اضافه شد و به ‌خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۷- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۸- به میزان ۶ میکرولیتر از محصول اتصال که برای مدت ۲ دقیقه روی یخ قرار داده شده بود به تیوب‌ها اضافه شد.
۹- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند و سپس ۶۶ میکرولیتر از هر تیوب روی محیط جامد حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین به ‌صورت چمنی کشت داده شد.
۱۰- پتری‌دیش‌ها برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه قرار داده شدند.
۳-۱۳-۳- انتخاب همسانه‌ها
برای تایید و اطمینان از انتقال دی‌ان‌ای نوترکیب مورد نظر به باکتری‌ها، از کلنی‌هایی که روی محیط حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین رشد کرده بودند تک کلنی‌هایی انتخاب و در کلنی پی‌سی‌آر استفاده شدند. جهت انجام کلنی پی‌سی‌آر به هر تیوب، پنج میکرولیتر محیط کشت LB اضافه شد و با سر لوپ از کلنی‌های منتخب، برداشته شد و برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه سانتیگراد روی شیکر رشد داده شدند. یک میکرولیتر از محلول رشد کرده به‌ جای دی‌ان‌ا طبق جدول (۳-۱۲) عمل پی‌سی‌آر انجام شد. پس از اتمام واکنش پی‌سی‌آر، محصول پی‌سی‌آر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.
جدول ۳-۱۲- چرخه‏های دمایی واکنش کلنی‏ پی‏سی‏آر.

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...