۲-۱- تیمار حیوانات

در این تحقیق، از رت های نر بالغ با وزن متوسط ۱۰۰ گرم استفاده گردید که از مرکز نگاهداری حیوانات آزمایشگاهی از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند.

۲-۱-۱ -القاء سرطان کولون در رتها

القاء سرطان کولون در رت ها توسط یک ماده کارسینوژن به نام ۱و ۲- دی متیل هیدرازین DMH)) صورت گرفت. DMH بلافاصله قبل از تزریق در EDTA 1 میلی مولار حل گردید و به منظور پایداری کارسینوژن، pH آن به کمک سود ۱/۰ نرمال به ۵/۶ رسانده شد. سپس DMH به صورت زیر جلدی (s.c) در ناحیه کتف، به مدت ۱۸ هفته ، هفته ای ۱ بار هر بار در دز mg/kg b.w30 و در حجم ۵۰۰ میکرولیتر ، به رتها تزریق شد. به گروه کنترل نیز همانند روش فوق ۵۰۰ میکرولیتر EDTA 1 میلی مولار تزریق شد. در این روش برای ایجاد سرطان ۶ ماه زمان لازم است.

۲-۱-۲- تیمار حیوانات با غذای حاوی پودر سیاه دانه

بازده اسانس به دست آمده از نمونه سیاه دانه ایرانی بسیار کم می باشد و متاسفانه گرفتن مقدار زیاد اسانس به منظور تیمار حیوانات با آن به مدت ۶ ماه امکان پذیر نیست و مستلزم صرف هزینه و زمان زیادی می باشد که مقرون به صرفه نیست. به همین دلیل با توجه به مطالعات انجام شده و تحقیق بسیار در این زمینه و مشاوره با متخصصین فیتوشیمیست و بیوشیمیست، تصمیم گرفته شد تا به جای اسانس از پودر سیاه دانه برای تیمار حیوانات در تحقیق استفاده گردد).
پودر سیاه دانه در غلظت های ۲ و ۴ درصد (وزنی/ وزنی) به غذای رت ها اضافه گردید. بدین ترتیب که غذای رت ها ابتدا به صورت پودر در آورده شد و سپس به ۱۰۰۰ گرم از آن حدود ۴۰۰ میلی لیتر آب اضافه شد تا کمی خیس گردد. سپس برای تهیه غذای حاوی پودر سیاه دانه ۲% و ۴% ، به ترتیب ۲۰ یا ۴۰ گرم از پودر سیاه دانه به آن افزوده و کاملا مخلوط گردید. سپس مخلوط حاصل مجددا به صورت پلت های کوچک در آورده شد و در هوای آزاد قرار داده شد تا خشک شود.
۲-۱-۳ –تهیه غذای رت ها
برای تغذیه رت ها به سه نوع غذا نیاز بود. غذای عادی ، غذای حاوی ۲% پودر سیاه دانه و غذای حاوی ۴% پودر سیاه دانه .
در تحقیقاتی که دکتر دادخواه و گروه همکار انجام داده بودند ، از پودر موجود در گونی های ۵۰ کیلویی غذای استاندارد موش که از انستیتو پاستور ایران تهیه می شد برای درست کردن غذای عادی و همچنین غذای حاوی پودرهای مورد نظر تحقیقات خود استفادهمی کردند که روندی طولانی و به علت کمبود پودر غذای استاندارد تهیه شده در انستیتو پاستور ایران وقت گیر بود .
از این رو و بر اساس استانداردهای موجود به این نتیجه رسیدیم که کنسانتره گاو شیری می تواند پودر تولید کند و تامین نیازهای غذایی رت ها را نیز بر عهده بگیرد . کنسانتره گاو شیری انتخابی محصول شرکت به پرور بود که پودر زیادی بدست می داد .
سیاه دانه مورد نیاز از شرکت های فروش مواد گیاهی تهیه گردید که همان سیاه دانه عادی مورد مصرفی در غذاهای انسانی است .
تهیه غذای عادی
کنسانتره گاوی خریداری شده ، الک می شود و پودر بدست امده از ان را جدا می نماییم . سپس با مخلوط کردن پودر با آب خمیری بدست می آوریم . خمیر را ورز داده و به خوبی یکسان سازی می نماییم . سپس با بهره گرفتن از قیف شیرینی پزی قالب هایی در اندازه تقریبی دو بند انگشت درست کرده و آنها را در پشه بندی قرار می دادیم تا از گزند حشرات و مگس ها در امان باشد . مواد بدست امده را به دور از نور خورشید و با جریان هوا خشک کرده و بعد از خشک شدن برای مصرف رت ها در گروه های کنترل منفی و کنترل مثبت یعنی گروه های ۱ و۲ مورد مصرف قرار می گرفت .
تهیه غذای حاوی ۲% پودر سیاه دانه
بعد از الک کردن کنسانتره و تهیه پودر ، وزن خشک غذا را محاسبه نموده و به میزان ۲% وزن خشک غذا پودر سیاه دانه را که قبلا تهیه نمودیم اضافه می کردیم . سپس با آب مخلوط کرده ، خمیر را دوباره به وسیله قیف شیرینی پزی از قالب هایی به اندازه تقریبی دو بند انگشت درست کرده و درون پشه بند و درسایه و در معرض جریان هوا و به دور از نور خورشید خشک می کنیم . بعد از آماده شدن ، این غذا در مصرف گروه های ۳ و ۴ قرار می گرفت .
« گروه ۳ همراه تزریق DMH و گروه ۴ همراه تزریق سرم فیزیولوژی EDTA . »
تهیه غذای حاوی ۴% پودر سیاه دانه
تمام مراحل قبلی را انجام داده و فقط به میزان ۴% وزن خشک غذا ، پودر سیاه دانه به کنسانتره الک شده اضافه می کردیم . بعد از آماده شدن مورد مصرف گروه های ۵ و ۶ قرار می گرفت .
« گروه ۵ همراه تزریق DMH و گروه ۶ همراه تزریق سرم فیزیولوژی EDTA . »
لازم به ذکر است که غذاها می بایست کاملا خشک بوده و سپس قابل مصرف برای رت هاست . زیرا مرطوب بودن غذا حیوان را در توانایی دریافت آنها عاجز می کند .
همچنین عدم خشک شدن غذا و وجود رطوبت در آن می تواند محیط کشت و رشد مناسبی برای انواع قارچ ها و میکروب ها باشد و حیوان بعد از مصرف ان غذای آلوده دچار بیماری و اختلالات ایمنی گردد . از این رو توجه به این مطلب در روند تغذیه حیوانات بسیار مهم و قابل ملاحظه و دقت است .
۲-۱-۴-تقسیم بندی حیوانات:
سپس حیوانات به صورت تصادفی در ۶ گروه تقسیم شدند (۸ سر رت در هر گروه).
– گروه کنترل: EDTA 1 میلی مولار به صورت s.c به مدت ۱۸هفته ، هفته‌ای ۱ بار هر بار ۵/۰ میلی لیتر ، به حیوانات تزریق شد و غذای معمولی دریافت کردند.
-گروه DMH : DMH حل شده در EDTA به صورت s.c به مدت ۱۸ هفته ، هفته ای ۱ بار هر بار در دوز mg/kg b.w30 و در حجم ۵/۰ میلی لیتر ، به حیوانات تزریق گردید و غذای معمولی دریافت کردند.
– گروه های sham: در این گروه ها همانند گروه کنترل EDTA تزریق شد و غذای حاوی ۲ و ۴ درصد از پودر سیاه دانه به مدت ۶ ماه به رت ها خورانده شد.
– گروه های تیمار با غذای حاوی۲ و ۴ درصد از پودر سیاه دانه و DMH : در این گروه ها DMH حل شده در EDTA در دوز mg/kg b.w30 همانند گروه DMH، به حیوانات تزریق شد و همزمان غذای حاوی ۲ و ۴ درصد از پودر سیاه دانه به مدت ۶ ماه به رت ها خورانده شد. (جدول ۲).

جدول ۲-۱. گروه‌های تیمار شده

رژیم غذایی حاوی ۴% پودر سیاه دانه
رژیم غذایی حاوی ۲% پودر سیاه دانه
DMH
EDTA
گروه ها

–
–
–
+
کنترل

–
–
+