شکل ۳-۳: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات

بافر استخراج حاوی موارد زیر است:
Tris-HCl…..۱۰mM
EDTA……….۲mM
NaCl………۰.۴mM
PH=8
نکته: EDTA مانع فعالیت سایر آنزیم‌ها می‌گردد. SDS به عنوان یک پاک کننده^[۶۰] غشا سلولی را مضمحل می‌کند. دمای بالا سبب می‌شود تا SDS غشا سلولی را بهتر شکسته و از هم گسیخته نماید و همچنین به اضمحلالل RNA کمک می‌کند.
۳- افزودن ۳۰۰ میکرولیتر NaCl 5/4 مولار به نمونه‌ها.
نکته: در استخراج DNA، وجود نمک با غلظت بالا پلی‌ساکاریدها را ته‌نشین می‌کند.
۴- ورتکس کردن^[۶۱] مجموعه به مدت کوتاه (حدود ۱۵ تا ۳۰ ثانیه).
۵- پانزده دقیقه سانتریفیوژ (شکل۳-۴) در ۱۱۰۰۰ دور و انتقال فاز بالایی به میکروتیوب جدید.
نکته: در این حالت DNA در مایع جمع آوری شده قرار داشته در صورتی که سایر مواد سلولی و پروتئین در مواد ته‌نشین شده تیوب قبلی باقی مانده‌اند.
۶- اضافه کردن کلروفرم (هم حجم مایع) و ده دقیقه سانتریفیوژ در ۳۰۰۰ دور.
۷- جداسازی فاز بالایی و انتقال به میکروتیوب جدید و اضافه کردن اتانول مطلق سرد (دو برابر حجم) و همچنین۱۰۰ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار.
شکل ۳-۴: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات
۸- سر و ته کردن میکروتیوب‌ها برای مشاهده کلاف DNA و سپس قرار دادن میکروتیوب‌ها در فریزر منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد برای یک شب.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۹- سانتریفیوژ به مدت ۱۰ دقیقه در ۸۰۰۰ دور.
۱۰- شستن پلیت با اتانول ۷۰ درصد.
نکته: اتانول، DNA موجود در مایع را رسوب می‌دهد زیرا آب در محلول با اتانول پیوند داده و سبب رهایی DNA می‌شود.
۱۱- سانتریفیوژ به مدت ۲ دقیقه در ۸۰۰۰ دور
۱۲- دور ریزی اتانول و خشک کردن پلیت‌ها در دمای اتاق.
۱۳- اضافه کردن ۵۰ میکرولیتر آب استریل (دوبار تقطیر) به هر کدام از میکروتیوب‌ها.
۳-۳- تعیین کیفیت DNA استخراج شده
۳-۳-۱- الکتروفورز DNA در ژل آگارز ۱ درصد
به منظور بررسی DNAهای استخراج شده، از ژل آگارز با غلظت ۱ درصد استفاده شد. برای تهیه آگارز ۱ درصد به مقدار ۱۲۰ میلی­لیتر، ۲/۱ گرم آگارز درون یک ارلن ریخته و به آن ۴/۲ میلی­لیتر از بافر x50 TBE اضافه شد، سپس با افزودن ۶/۱۱۷ میلی­لیتر آب مقطر محلول تهیه شده را به مدت ۲-۱ دقیقه درون مایکروفر قرار داده و پس از این که محلول شروع به جوشیدن کرد و کاملاً شفاف شد، آن را از مایکروفر بیرون می آوریم. پس از پایین آمدن دمای ژل، ۳ میکرولیتر اتیدیوم بروماید زیر هود به محلول اضافه و پس از یکنواخت کردن، محلول در سینی ژل ۱۲۰ میلی­لیتری که قبلاً آماده شده بود ریخته شد. مخزن ژل روی یک سطح تراز قرار داده شد تا ضخامت ژل در همه قسمت ­ها یکنواخت باشد.
شانه­ها قبل از اینکه ژل بسته شود درون آن قرار گرفته و پس از بستن ژل، حایل‌‌های ۲ طرف سینی ژل را باز کرده و ژل همراه شانه به آرامی درون تانک الکتروفورز حاوی بافر x1 TBE منتقل شد. پس از چند دقیقه شانه به آرامی بیرون کشیده شد.
برای بارگذاری DNA ژنومی از نسبت ۳ میکرولیتر DNA ژنومی، ۳ میکرولیتر بافر بارگذاری^[۶۲] و ۳ میکرولیتر آب مقطر استفاده شد. پس از بارگذاری در دستگاه الکتروفورز افقی (شکل ۳-۹)، جریان ۱۰۰ ولت به مدت ۱ ساعت برقرارگردید و زمانی که رنگ پایین به حدود ۲ سانتی­متر پایین ژل رسید، جریان الکتریسته قطع شد. پس از اتمام الکتروفورز با مشاهده نوارها در زیر نور ماوراء بنفش غلظت DNA نمونه­ها با DNA استاندارد ۵۰، ۱۰۰ و ۱۵۰ نانوگرم، مقایسه شد و کیفیت DNA با مشاهده شکل نوارها مشخص شد (شکل۳-۵). برای مشاهده و عکسبرداری DNA از دستگاه Bio DOC Analyzer (شکل ۳-۱۰) استفاده شد.

شکل ۳-۵: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز ۱ درصد

۳-۳-۲- بررسی غلظت DNA استخراج شده
برای تعیین مقدار DNA کل (کمی) نیز از دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر (شکل ۳-۶) استفاده شد. مقدارDNA بر حسب نانوگرم در میکرولیتر تعیین گردید. نمونه‌های با نسبت جذب نوری ۲۸۰-۲۶۰ بین ۸/۱ تا ۲ به دلیل خلوص بالا و آلودگی پایین مورد استفاده قرار گرفت.
شکل ۳-۶: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA
۳-۳-۳- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت ng/µl25
نمونه‌های با غلظت مناسب برای رقیق سازی انتخاب شده و با بهره گرفتن از فرمول زیر میزان ۵۰ میکرولیتر DNA با غلظت ng/µl 25 بدست آمد. Ng/µl 25× ۵۰= X × غلظت خوانده شده
۳-۴- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
در این مطالعه از آغازگرهای^[۶۳] زیر استفاده شد:
P1: AGAGAGAGAGAGAGAGT
P2: GAGAGAGAGAGAGAGAC
P3: ACACACACACACACACG
P4: ACACACACACACACACYT
P5: GAGAGAGAGAGAGAGAA