جدول ۱۳. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحم
در رحم­های واجد و فاقد لومن در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE) 45
جدول ۱۴. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز، درصد نوتروفیل و تعداد تلقیح
در ساختارهای غالب متفاوت تخمدانی در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE) 46
جدول ۱۵. ضریب همبستگی شاخص­ های تولیدمثلی با یکدیگر ۴۶
جدول ۱۶. عوامل خطر همراه با احتمال وقوع اندومتریت بالینی تشخیص داده شده
در معاینه اول و دوم ۴۷
فهرست تصاویر
عنوان صفحه
تصویر ۱. محصولات PCR استاندارد DNA ژنومی ترشحات رحمی ۴۰
تصویر ۲. محصولات واکنش زنجیره­ای استاندارد و چندتایی DNA ژنومی
ترشحات رحمی برای باکتری­ های E. coli، T. pyogenes، F. necrophorum

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

و P. melaninogenicus 41
فصل اول
مقدمه
دوره پس از زایمان به دلیل اثراتی که بر کارایی تولید­مثلی و آبستنی مجدد دارد، به عنوان یک مرحله مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب می­ شود. آلودگی رحم به باکتری­ ها، به طور معمول در طی دو هفته ابتدایی پس از زایش رخ می­دهد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). 80 تا ۱۰۰ درصد گاوها آلودگی باکتریایی رحم را در دو هفته اول پس از زایش دارند (Földi et al. 2006). در این مدت دامنه وسیعی از فلور میکروبی در رحم تکثیر می­ کنند. هر چند رحم بیشتر گاوها در فرایندهای بازسازی رحم و بازگشت آن به اندازه طبیعی، در طی پنج هفته اول پس از زایش، از این آلودگی­های باکتریایی پاک می­شوند اما در تعدادی از گاوها این آلودگی­ها توسعه پیدا کرده و عفونت­های رحمی قابل تشخیص با معاینه بالینی را ایجاد می­ کنند (Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a).
اندومتریت پس از زایش به صورت التهاب محدود به اندومتریوم (لایه داخلی رحم) که ۲۱ روز یا بیشتر پس از زایش و بدون نشانه­ های بیماری عمومی رخ می­دهد، تعریف شده است (Sheldon et al. 2006a). تشخیص اندومتریت بالینی با قطر گردن رحم بیش از ۵/۷ سانتی­متر در ملامسه راست روده­ای بعد از روز ۲۰ پس از زایش یا از حضور ترشحات مهبلی موکوسی-چرکی یا چرکی بعد از روز ۲۶ پس از زایش تعریف شده است (LeBlanc et al. 2002a).
میزان شیوع اندومتریت در کشورهای مختلف بسیار متفاوت بوده است. این میزان از ۵/۴-۶/۲ در اسپانیا (Lopez-Gatius 2003)، ۱۰ درصد در بریتانیا (Noakes et al. 2009)، ۲۵ درصد در ژاپن (Gautam et al. 2009)، تا ۵۳ درصد در ایالات متحده (Gilbert et al. 2005) متغیر بوده است که این تفاوت می ­تواند به دلیل عدم توصیف روش­های تشخیصی، معیارهای متفاوت درجه بندی عفونت­های رحمی، دوره پس از زایشی که هنگام تشخیص عفونت گاو در آن قرار داشته، تعداد زایش گاو و مدیریت متفاوت گله­ها باشد (Lewis 1997; Noakes et al. 2009). در مطالعات قبلی در گاوداری­های ایران میزان وقوع اندومتریت بالینی درجه ۱ تا ۳ بیش از ۵۰ درصد بود (احمدی و همکاران، اطلاعات منتشر نشده).
اندومتریت تاثیرات نامناسب بر تولید­مثل و باروری گاو گذاشته و خسارات اقتصادی فراوانی را وارد می ­آورد. حضور باکتری در رحم، التهاب و آسیب­های بافتی اندومتریوم را در پی دارد و سبب تأخیر در بازسازی رحم و همچنین به خطر افتادن حیات رویان می­ شود (Azawi 2008; Sheldon et al. 2006a). همچنین عفونت باکتریایی رحم و یا مواد تولید شده از این باکتری­ ها سبب سرکوب ترشح LH هیپوفیز و نقص در عملکرد و رشد فولیکول­های تخمدانی پس از زایمان و در نتیجه اختلال در تخمک­گذاری می­ شود (Opsomer et al. 2000; Sheldon et al. 2002b). بنابراین اندومتریت سبب کاهش احتمال باروری شده و افزایش فاصله زایش تا اولین تلقیح و افزایش نسبت تلقیح به ازای آبستنی (از ۲ به ۴۲/۲) و افزایش فاصله زایش­ها (۱۰ تا ۳۱ روز) را در پی دارد (Azawi 2008; LeBlanc et al. 2002a; Noakes et al. 2009). گاوهای مبتلا به ترشحات مهبلی چرکی برای آبستن شدن به میانگین ۳۰ روز زمان بیشتر نسبت به گاوهای غیر مبتلا نیاز دارند که حداقل ضرر اقتصادی طولانی شدن روزهای باز را دارد که حدود ۳ دلار در روز می­باشد (Dubuc 2011). پس اندومتریت می ­تواند سبب کاهش میزان باروری و افزایش نرخ حذف به دلایل ناباروری شود. نتیجه اینکه اندومتریت می ­تواند اثر فراوانی در کاهش سودآوری گله­های گاو شیری داشته باشد. این خسارات به دلیل افزایش فاصله زایمان تا آبستنی مجدد، افزایش میزان حذف، کاهش تولید شیر و تحمیل هزینه­ های درمان می­باشد (Drillich 2006; LeBlanc et al. 2002a) به گونه ­ای که خسارات آن را برای هر گاو مبتلا ۱۶۶ پوند (Noakes et al. 2009) محاسبه کرده ­اند.
عوامل بیماری­زای اندومتریت بسیار پیچیده هستند. بسیاری از مطالعات پیشنهاد کرده ­اند که باکتری­ های بیماری­زا نقش مهمی در بروز و وخیم شدن اندومتریت دارند (Sun et al. 2011). معمول­ترین شروع کننده­ های عفونت اندومتریت باکتری­ های بیماری­زای فرصت طلب غیر اختصاصی هستند که در اطراف زمان زایمان و پس از آن رحم را آلوده می­ کنند (Sheldon et al. 2006a). به نظر می­رسد عفونت رحم به Escherichia coli در اوایل دوره پس از زایش، راه را برای عفونی شدن توسط سایر باکتری­ ها هموار می­ کند (Westermann et al. 2010; Williams et al. 2005). متعاقب آن رشد زیاد باکتری­ های بیماری­زایی چون pyogenes Trueperella (Arcanobacterium pyogenes) (که معمولا باکتری­هایی چونFusobacterium necrophorum و Prevotella melaninogenicus همراه با آن هستند) به لایه­ های اندومتریوم نفوذ می­ کنند (Drillich 2006; Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a). میزان عفونت ایجاد شده و نتیجه آلودگی را گونه باکتری بیماری­زا، میزان باکتری وارد شده و توانایی گاو برای بروز پاسخ ایمنی مناسب تعیین می­ کنند که می ­تواند از عفونت رحمی شدید همراه با به خطر افتادن زندگی تا عفونت خفیف لایه داخلی رحم متغیر باشد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). گرچه در پایدار شدن و باقی ماندن عفونت در رحم عواملی چون مساعد بودن محیط رحم، فاکتورهای ژنتیکی و ایمنی ذاتی و اکتسابی حیوان دخالت دارند اما شدت اندومتریت و آسیب­های وارده به رحم ارتباط مستقیمی با جنس و گونه باکتری­ های آن دارد. Trueperella pyogenes معمول­ترین باکتری مرتبط با بیماری­های رحمی و اندومتریت است (Bicalho et al. 2010; Sheldon et al. 2004; Yavari et al. 2007). در کنار آن باکتری­هایی چون Fusobacterium necrophorum و melaninogenicus Prevotella و Escherichia coli از دیگر باکتری­ های بسیار مطرح در آسیب­های رحمی و در رده اول بیماری­زایی برای رحم هستند (Sheldon and Dobson 2004; Williams et al. 2005). در ضمن این باکتری­ ها به رشد همدیگر کمک کرده و اثرات هم را تشدید می­ کنند (Sheldon and Dobson 2004; Westermann et al. 2010). به گونه ­ای که T. pyogenes کمک به ایجاد محیط بی­هوازی برای رشدF. necrophorum وmelaninogenicus P. می­ کند. F. necrophorum اندوتوکسین کشنده سلول­های دفاعی را تولید می­ کند که توانایی سیستم دفاعی میزبان برای پاکسازی رحم از T. pyogenes را محدود می­ کند. در همین حال melaninogenicus P. مواد تداخل کننده در فاگوسیتوز را تولید می­ کند (Sheldon and Dobson 2004). در نتیجه این سه باکتری معمولا در کنار هم و در ارتباط با هم جداسازی شده ­اند.
با توجه به اینکه اندومتریت اثری بر سلامت ظاهری گاو مبتلا ندارد از روش­های گوناگونی برای تشخیص آن در گاو استفاده کرده ­اند (Youngquist and Threlfall 2007) که شامل: ملامسه رحم از راه راست­روده (Drillich 2006; Lewis 1997)، بررسی حضور ترشحات چرکی در واژن و دهانه خارجی گردن رحم (LeBlanc et al. 2002a; Williams et al. 2005)، اولتراسونوگرافی (Barlund et al. 2008; Oral et al. 2009)، بیوپسی رحم و مطالعات آسیب­شناسی (Bonnett et al. 1991)، مطالعات سلول شناسی (Ahmadi et al. 2005; Oral et al. 2009; Yavari et al. 2009) و مطالعات میکروب­شناسی (Földi et al. 2006; Yavari et al. 2007) می­باشد اما این روش­ها بیشتر برای تایید اندومتریت استفاده می­شوند و کمتر برای تشخیص عامل بیماری­زا قابل استفاده هستند یا اینکه وقت­گیر، با حساسیت پایین و پیچیده هستند.
باید توجه داشت که تشخیص قطعی اندومتریت بر اساس معاینه بافت­شناسی و آسیب­شناسی از نمونه­های بیوپسی اندومتر و یا با بررسی باکتری­شناسی نمونه­های جمع­آوری شده از مجرای رحم قابل اطمینان است. با توجه به اینکه بیوپسی بر بافت رحم و گردن رحم اثرات نامطلوب گذاشته و ناباروری ایجاد می­ کند، استفاده از آن روشی قابل توصیه و مناسب نمی ­باشد (Youngquist and Threlfall 2007). اما در کشت باکتری­ ها نیز محدودیت­هایی وجود دارد که استفاده از آنها را دچار ابهام می­ کند. به عنوان مثال، برای کشت برخی باکتری­ ها مثلF. necrophorum باید شرایط خاص (اجبار در استفاده از محیط کشت اختصاصی، ایجاد شرایط خاص بی­هوازی و همچنین مدت زمان طولانی مورد احتیاج برای کشت) فراهم شود که این روش را تبدیل به فرایندی زمان­بر، هزینه­بر و با زحمت زیاد کرده است. نکته مهم دیگر اینکه در مطالعات باکتری شناسی جدا شدن باکتری به عنوان دلیلی قاطع مبنی بر وجود عفونت در رحم تلقی می‌شود، چنانچه از آن به عنوان یک شاخص برای تعیین موارد مثبت کاذب روش واژینوسکوپی استفاده شده است (Westermann et al. 2010) ولی در صورتی که چرک مشاهده و باکتری جدا نشود نمی‌توان نتیجه گرفت که وجود چرک، ناشی از التهاب غیر عفونی است به خصوص در مورد باکتری­ های سخت رشد و بی­هوازی چونF. necrophorum وmelaninogenicus .P. در بسیاری مطالعات تعداد زیادی نمونه رحمی بدون رشد هیچ گونه باکتری گزارش شده است (Ahmadi et al. 2007; Westermann et al. 2010). از جمله در مطالعه یاوری و همکاران از کشت رحم ۸۹ راس گاو مبتلا به اندومتریت بالینی تهیه شده از گاوداری­های ۵ استان، فقط از ۳۵ مورد (۳/۳۹ درصد) باکتری جدا شد و تنها در ۱۹ گاو دو باکتری بیماری­زای اصلی (T. pyogenes و E. coli) مشاهده شد (Yavari et al. 2007). در صورت مشاهده چرک و جدا نشدن باکتری (۷/۶۰ درصد) نمی‌توان نتیجه گرفت که وجود چرک، ناشی از التهاب غیر­عفونی است. بنابراین معرفی و استفاده از روش­هایی که کاستی­ها و مشکلات مطالعات باکتری شناسی بر مبنای کشت را از میان بردارد، دارای اهمیت بسیار است و احتیاج است که تعیین شود آیا روش­های پیچیده­تر مثل PCR دقت تشخیص را افزایش خواهند داد (Westermann et al. 2010).
در حال حاضر PCR به عنوان یک فن­آوری قدرتمند برای تشخیص و توصیف میکروارگانیسم­ها بدون احتیاج به کشت تایید شده است (Guo et al. 2012). برخی تلاش­ها برای شناسایی باکتری­ ها از ترشحات رحمی توسط PCR صورت گرفته است (Bicalho et al. 2012; Guo et al. 2012; Liu et al. 2009). به کار گرفتن روش multiplex PCR سبب سهولت و افزایش سرعت انجام کار و هزینه کمتر نسبت به روش استاندارد می­ شود (Tramuta et al. 2011) اما پروتکل­های اندکی برای تشخیص عوامل عفونی ترشحات اندومتریت به روش multiplex PCR پیشنهاد شده ­اند (Sun et al. 2011).
بنابراین اهداف این مطالعه در ابتدا جستجوی باکتری­ های بیماری­زای اصلی رحم
(T. pyogenes، F. necrophorum، melaninogenicus P. و E. coli) در گاوهای مبتلا به اندومتریت به روش PCR بود. در روش PCR بررسی­ها مستقیم بر روی ژنوم نمونه صورت
می­گیرد و در صورت حضور باکتری قطعه­های خاص از DNA آن را تکثیر کرده و حضور آن را با حساسیت بسیار معین می­ کند. این روش شناسایی باکتری­هایی را که در محیط­های کشت سخت­رشد و دیر رشد هستند مثل F. necrophorum وmelaninogenicus P. امکان­ پذیر می‌سازد. چنانچه در مطالعه‌ای وسیع کشت باکتریایی از رحم گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی انجام داده شد اما دو باکتری نامبرده فوق جدا نشدند (Yavari et al. 2007). همچنین تلاش شد تا یک پروتکل multiplex PCR برای این باکتری­ های بیماری­زا طراحی شود. بررسی رکورد شاخص­ های تولید­مثلی در راستای شناسایی اثرات ابتلا با باکتری­ های اصلی بیماری­زای رحم گاوهای شیری نیز از دیگر اهداف مطالعه بود.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات گذشته
۲-۱- فیزیولوژی پس از زایش
۲-۱-۱- مکانیسم بازسازی رحمی
مکانیسم بازسازی رحم پروسه­ای پیچیده است که بلافاصله پس از زایش شروع شده و شامل انقباضات رحمی، چروکیده، نکروز و پوسته شدن کارونکل­ها و بازسازی اندومتریوم می­باشد (Sheldon 2004). تعداد روزهای بازسازی رحم بین مطالعات مختلف متفاوت است. مورو گزارش کرد که مکانیسم بازسازی رحمی در ۲۰ تا ۲۵ روز کامل می­ شود
(Morrow et al. 1966) اما در مطالعه­ ای دیگر مشخص شد که فقط بازسازی اپیتلوم در آن زمان کامل می­ شود و لایه­ های زیرین بافت رحمی برای ترمیم کامل نیاز به ۶ تا ۸ هفته فرصت دارند (Sheldon et al. 2008). گردن رحم نیز همزمان با بازسازی رحم کوچک می­ شود اما سرعتی کمتر از آن دارد (Sheldon et al. 2006a).
لوشیای رحم ترشحی است که بلافاصله پس از زایش آشکار شده و ۱۲ تا ۱۸ روز پس از زایش دیده می­ شود. لوشیا شامل قسمت­ های نکروزه­ی کارونکل­های رحمی، خون و مایعات جنینی است. لوشیا با کمک انقباضات میومتریوم از رحم بیرون ریخته می­ شود و ترشح فیزیولوژیک طبیعی است و نباید با پیومتر و متریت اشتباه شود (Dhaliwal et al. 2001; Sheldon and Dobson 2004).
۲-۱-۲- آلودگی و پاک شدن باکتری­ ها از رحم پس از زایش
در گاوهای آبستن فرج، دهلیز، مهبل و گردن رحم به عنوان سدهای طبیعی رحم را در مقابل آلودگی باکتریایی در طی آبستنی محافظت می­ کنند. شل شدن فرج و باز شدن گردن رحم در طی زایمان به باکتری­ ها فرصت ورود به رحم را می­دهد (Azawi 2008; Sheldon 2004). بنابراین آلودگی باکتریایی پس از زایش معمول است. نشان داده شده است که ۳۳ درصد گاوهای شیری در طی هفته اول پس از زایش کشت باکتریایی مثبت داشتند (Fredriksson et al. 1985). تحقیقات اخیر نشان داد که در طی دو هفته ابتدایی پس از زایش تقریبا ۸۰ تا ۱۰۰ درصد گاوها دچار عفونت رحمی می­شوند (Földi et al. 2006; Sheldon 2004). در ابتدای پس از زایش، کارونکل­های نکروزه، خون و ضایعات سلولی محیط مناسبی برای رشد باکتری­ ها فراهم می­آورند. در شرایط طبیعی، پروسه بازسازی رحمی به طرز موثری ضایعات را بیرون ریخته و ترمیم اندومتریوم را پیش می­برد، بنابراین درصد گاوهای دارای عفونت رحمی باقیمانده در ۳ هفته پس از زایش به ۴۰ درصد کاهش می­یابد. با این وجود در ۱۰ تا ۱۷ درصد گاوهای پس از زایش، شرایط مطلوب رشد باکتری­ ها باقی مانده و در نتیجه اندومتریت رخ می­دهد (Sheldon 2004). عوامل اختصاصی که پاکسازی باکتری­ ها از رحم پس از زایش را به تاخیر می­ اندازد شامل میزان و طبیعت آلودگی باکتریایی، درجه بازسازی رحمی، باقی ماندن پرده­های جنینی و وضعیت ایمنی گاو است (Sheldon et al. 2006a).
۲-۱-۳- عفونت باکتری­ های بیماری­زا در رحم
باکتری­ های بیماری­زایی که معمولا از رحم گاوهای پس از زایش جدا می­شوند شامل Escherichia coli، Streptococci spp، Trueperella pyogenes، Bacillus licheniformis، Prevotella spp و Fusobacterium necrophorum هستند. از بین آنها مهم­ترین و
معمول­ترین باکتری­ های بیماری­زا E. coli، T. pyogenes، F. necrophorum
و P. melaninogenicus می­باشند (Földi et al. 2006). برخی باکتری­ ها شامل T. pyogenes، F. necrophorum و P. melaninogenicus در تشدید بیماری رحمی هم­افزایی دارند (Bonnett et al. 1991; Singh et al. 2008). هر یک از این گونه­ ها، موادی تولید می­ کنند که رشد باکتریایی را زیاد می­ کند. F. necrophorum به بافت­های رحمی حمله کرده و سمی کشنده سلول­های دفاعی را تولید می­ کند که از فاگوسیتوز جلوگیری می­ کند (Sheldon and Dobson 2004; Singh et al. 2008). T. pyogenes، که با سم کشنده سلول­های دفاعی محافظت می­ شود، به نوبه خود کاتالاز و یک فاکتور رشد تولید می­ کند که ازدیاد F. necrophorum را موجب می­ شود (Singh et al. 2008). گزارش شده است که باقی ماندن عفونت با T. pyogenes بعد از روز ۲۱ پس از زایش، نرخ باروری را در اولین تلقیح کاهش داده است (Singh et al. 2008). ارزیابی ظاهر و بوی ترشحات مهبل نشان داد که T. pyogenes، F. necrophorum و Proteus spp مرتبط با ترشحات چرکی و موکوسی-چرکی مهبل هستند در حالی که T. pyogenes، E. coli و non-hemolytic Streptococci مرتبط با بوی بد ترشحات بودند (Williams et al. 2005).
۲-۱-۴- فعالیت تخمدانی پس از زایش در گاوهای شیری
در اواخر آبستنی، محور هیپوتالاموسی-هیپوفیزی تحت اثر فیدبک منفی استروژن­ها و پروژسترون تولید شده توسط جفت و تخمدان­ها است. بنابراین، اولین تخمک­گذاری بین ۱۴ تا ۲۸ روز پس از زایش رخ می­دهد (Yavas and Walton 2000). بازگشت فعالیت چرخه تخمدانی پس از زایش به پاسخ ایمنی رحم هم اثر می­ گذارد و هم وابسته به آن است. در حقیقت، غلظت بالای پروژسترون در طول مرحله لوتئال پاسخ ایمنی رحم را سرکوب کرده و رحم را به عفونت باکتریایی حساس­تر می­سازد (Lewis 2003). تخمک­گذاری زود هنگام و بالا رفتن غلظت پروژسترون محیطی قبل از پاکسازی آلودگی باکتریایی با پایداری پیومترا در گاوهای پس از زایش مرتبط است (Sheldon and Dobson 2004). نشان داده شد که تزریق داخل رحمی T. pyogenes و E. coli در گاوهای گوشتی پس از زایش هنگامی که غلظت پروژسترون در حد پایه بود عفونت رحمی ایجاد نکرد. هر چند هنگامی که تزریق پس ازشروع مرحله لوتئال و افزایش غلظت پروژسترون انجام شد، در همه گاوها عفونت رحمی ایجاد گشت (Del Vecchio et al. 1994). با این وجود مکانیسم­های رخداد این مشاهدات مشخص نشده است. به عنوان مثال، در مطالعه­ ای نشان داده شد که عملکرد نوتروفیل­های رحم یا خون در گاو توسط استروژن خارجی افزایش و همچنین توسط پروژسترون کاهش پیدا نکرد
(Subandrio et al. 2000).
۲-۲- تعریف بیماری­های رحمی
انواع مختلفی از بیماری­های رحمی در مدت پس از زایش در گاوهای شیری وجود دارد. متریت، پیومتر، اندومتریت بالینی و اندومتریت تحت بالینی معمول­ترین بیماری­های گزارش شده هستند.
۲-۲-۱- متریت
متریت یک بیماری رحمی است که با کسالت عمومی، تب، ضعف، بی­اشتهایی، کاهش تولید شیر و رحم بزرگ شده با ترشحات آبکی یا چرکی تعریف شده است (Bondurant 1999; Sheldon et al. 2006a). متریت معمولا در دوره نفاسی (دو هفته اول پس از زایش) رخ
می­دهد (Sheldon et al. 2006a) و شامل التهاب همه لایه­ های رحم: موکوس و زیرموکوس اندومتریوم، موسکولاریس و سروزا می­ شود (Bondurant 1999). عوامل مستعد کننده آن جفت ماندگی، سخت زایی و گندیدگی جنین است (Chapwanya 2008; Földi et al. 2006; Sheldon et al. 2006a).
۲-۲-۲- پیومتر
پیومتر با جمع شدن ترشحات چرکی با مقادیر مختلف در مجرای رحم همراه است. این شرایط بیشتر در گاوهایی ایجاد می­ شود که اولین تخمک­گذاری پس از زایش آنها پیش از پاکسازی رحم از آلودگی باکتریایی رخ دهد (Chapwanya 2008; Földi et al. 2006). هرچند گردن رحم بسته است، مجرا همیشه کاملا بسته نیست و ممکن است اندکی چرک از طریق گردن رحم به مجرای واژن راه یابد. نشانه­ها در زمان تشخیص سونوگرافی پیومتر، حضور جسم زرد در تخمدان و تجمع مایعات با اکوژنیسیتی مخلوط در مجرای رحم و اتساع رحم است
(Sheldon et al. 2006a).
۲-۲-۳- اندومتریت