روش: به یک آمپول لیوفیلیزه حاوی بروسلا ، ۰/۵ میلی لیتر، محیط بروسلا براث افزوده شد و سوسپانسیون باکتری با کمک سرنگ به ۴/۵ میلی لیتر محیط بروسلا براث تازه تهیه شده اضافه شد و ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شد. سپس ۰/۵ میلی لیتر از لوله اوّل به لوله دوم حاوی ۴/۵ میلی لیتر محیط بروسلا براث افزوده و ۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شد. سپس ۰/۵ میلی لیتر از لوله دوم به لوله سوم حاوی میلی لیتر محیط بروسلا براث افزوده و ۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شد و ۰/۵ میلی لیتر از لوله سوم بر روی پلیت حاوی بروسلا آگار برای ایجاد کلنی تک کشت داده و در ۳۷ درجه به مدت ۷۲ ساعت نگهدای شد.از لوله کوچک به عنوان کنترل برای تشخیص کلنی های صاف و خشن استفاده شد، که سویه S99 با آنتی سرم صاف آگلوتینه شده و اکریفلاوین ۰/۶ % آگلوتین ه نمی شود. سویه خشن RB51 با آنتی سرم صاف آگلوتینه نشده و با اکریفلاوین ۰/۶ %(W/V) اگلوتینه شد.بعد از تاٌیید سویه های مورد نظر، برای تهیه بذر ، از لوله های بزرگ استفاده شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۳٫ کنترل سوش لیوفیلیزه از نظرRough و Smooth بودن:
یک لوله کوچک از سویه RB51 را برداشته، یک لوپ را روی پلیت درون یک قطره سرم فیزیولوژی سوسپانسیون کرده و آنتی سرم مثبت B.abortus یا آکروفلاوین مجاور کرده و ٢ دقیقه با اپلیکاتور هم زده می شود. هم چنین، یک لوپ از سویه RB51 را هم با B.melitensis مجاور کرده، اگر هر یک از خانه ها آگلوتیناسیون بدهد، نشانه این است که سویه لیوفیلیزه ما Rough است.
شکل(۳-۱) کنترل سوش RB51 با بهره گرفتن از اکروفلاوین
۳-۴٫ تهیه بیوماس سلولی
مواد و وسایل: انکوباتور ۳۷ درجه، PBS(بافرفسفات نمکی) با PH= 6.4، بوآت، سانتریفیوژ
روش: محتوای باکتری حاصل از هر لوله کشت (لوله های بزرگ) در یک لیتر بروسلا براث به تعلیق در آمد و به عنوان بذر مورد استفاده قرار گرفت. ۵ میلی لیتر بذر به هر بطری بوآت حاوی مقداری محیط بروسلا آگار اضافه و به مدت ۷۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه کشت داده شد.پس از کنترل چشمی از نظر آلودگی زهر آبه آنها خارج شده و ۱۰ میلی لیتر PBS به هر بطری اضافه گردید. با تکان های متناوب ، کلنی های باکتری از سطح آگار شسته شد.تعلیق باکتری در یک بطری بزرگتر جمع آوری گردید،که به آن مایع غلیظ گفته می شود. جهت آلوده نبودن هوازی ، بی هوازی و قارچی مایع غلیظ ، نمونه ای از آن در لوله های بروسلا آگار ، تیوگلیکولات براث و سابرو براث کشت شد و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری گردید. مایع غلیظ دو مرتبه با PBS استریل و دور ۳۵۰۰ rpm به مدت ۲۰دقیقه سانتریفیوژ گردید که به رسوب حاصل ، توده سلولی یا بیوماس سلولی گفته می شود.
شکل (۳-۲)کشت و درو بروسلا
۳-۵٫ استخراج و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99
مواد و وسایل: سانتریفیوژ، شیکر، ترازو،بن ماری ،کیسه دیالیز، محلول فنل ۹۰%، متانول، PBS، آب مقطر،
روش: استخراج به روش فنول داغ اصلاح شده انجام شد(۲۳).به ۵۰ گرم بیوماس سلولی، ۱۵۳ میلی لیتر آب مقطر افزوده و در دمای ۶۸ درجه به مدت ۵ دقیقه در بن ماری قرار داده شد و سپس به مخلوط فوق، ۱۷۱ میلیلیتر فنول ۹۰% اضافه گردید و در دمای ۶۸ درجه به مدت ۳۰ دقیقه در بن ماری قرار گرقت. سپس محلول را بر روی یخ سریعا سرد کرده و سانتریفیوژ گردید(۳۵۰۰rpm،۴۵ دقیقه در ۴ درجه).لایه فنولی را جدا کرده و به آن ۲۵ درصد اتانول اضافه نموده و در دوره ۳۹۰۰ به مدت ۳۰ دقیقه سانتریفیوژ نموده تا پروتئین و اسید نوکلئیک خارج شود.سپس به مایع رویی الکل اضافه نموده تا ۷۰ درصد شود و سانتریفیوژ نموده تا LPS رسوب کند.سپس رسوب را در آب مقطر حل کرده و بر علیه هر ۸ ساعت تعویض آب مقطر به مدت ۲۴ ساعت دیالیز نمودیم و سپس با عبور از فیلتر ۰/۲۲ میلی پور استریل نموده و در ویال تقسیم کردیم.
شکل(۳-۳):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده
۳-۵-۱٫ د تو کسیفیه کردن LPS با روش قلیایی
مواد و وسایل: ویال حاوی LPS، سود ۰/۲ نرمال، بن ماری، اسید کلریدریک ۰/۱ نرمال، آب مقطر، کیسه دیالیز
روش: به ۲ ویال ۵ میلی گرمی لیپوپلی ساکارید تخلیص شده ، ۲ میلی لیتر سود ۰/۲ نرمال اضافه نموده ومقداری تکان داده تا محلول یکنواختی به دست آید و به مدت ۲ ساعت در دمای ۱۰۰ درجه در بن ماری قرار داده شد. بعد از این زمان ، نمونه را خنک نموده وسپس اسیدیته محلول را با HCL 0/1 نرمال به PH=7 رسانیده و بر علیه هر ۸ ساعت تعویض آب مقطر، به مدت ۷۲ ساعت دیالیز نمودیم تا اسید های چرب آزاد شده حذف گردید.
۳-۵-۲٫ آزمون Novotny:
مواد و وسایل:LPS استاندارد سالمونلا تیفی موریوم، معرف DMB (1و۹ دی متیل بلو)، اسپکتروفوتومتر
روش: غلظت LPS در نمونه استخراج شده با کمک معرف DMB محاسبه می گردد. به صورت دوپلیکیت در سه لوله آزمایش به ترتیب،۱۵۰ میکرولیتر نمونه LPS ریخته و با آب مقطر به حجم ۱/۵ میلی لیتر می رسانیم.در لوله دیگر به عنوان بلانک فقط ۱/۵ میلی لیترآب مقطر می ریزیم و در لوله آخر ۵۰ میکرو لیتر نمونه LPS استاندارد (LPS استاندارد سالمونلا تیفی موریوم در علظت های ۲/۵-۱۰۰ میکرو گرم در میکرولیتر) ریخته و با آب مقطر به حجم ۱/۵ میلی لیتر می رسانیم و به همه لوله ها ۱/۵ میلی لیتر معرف DMB اضافه نموده و هم میزنیم وسپس سریعا در ۵۳۵ نانومتر OD نمونه را نسبت به بلانک خوانده ومیانگین آنرا بدست آورده و از معادله منحنی استاندارد غلظت LPS ذر نمونه را محاسبه می نمائیم(۳،۲۳)
۳-۶٫ استخراج و خالص سازی Omp بروسلا آبورتوس RB51
وسایل: سانتریفیوژ، اولتراسانتریفیوژ،فیلتر ۰/۴۵ میلی پور، کیسه دیالیز
محلول های مورد نیاز: بافر تریس (مرک)
محلول ۰/۰۱مولار بافر تریس با PH=7/5 تهیه گردید و PH با HCL تنظیم شد.
EDTA( اتیلن دی آمین تترا کلرو استیک اسید)(مرک)
پودر EDTA را به اندازه ۱۰mM(وزن مولکولی EDTA،۳۷۲ گرم است،اگر این مقدار در یک لیتر حل شود یک مولار میشود.برای تهیه ی ۱۰mM ،۱/۱۰۰ یعنی ۳/۷ را در یک لیتر میریزیم)، در یک لیتر بافر تریس که قبلا تهیه کردیم ،حل گردید.(PH=7/5)
سدیم لوریل سارکوزینات:
برای تهیه ی محلول ۲% سدیم لوریل ساکوزینات،۲ گرم از ماده را در ۱۰۰ سی سی بافر تریس حاوی EDTA ،۱۰ میلی مولار آب مقطر حل گردید.
۳-۶-۱٫استخراج:
توده سلولی به ازاء هر ۱ گــرم وزن مرطوب در ۱۰۰ ml بــافر تریس هیدروکلراید ۱۰mM(PH 7/5) معلق و ازای ۱۰۰ml از تعلیق فوق، ۱ میلی گرم از DNAase و RNAase اضافه شد.نمونه ها روی یخ نگهداری و بادستگاه سونیکاتور (Bronson) با سیکل پیوست )۷ پالس در ۱ دقیقه) تیمار شدند.نمونه ها دو بار در ۳۰۰۰g مدت ۱۵ دقیقه در ۴درجه، جهت حذف سلول های شکسته نشده، سانتریفیوژ شدند.در ادامه محلول رویی در ۴۳۵۰۰ rpm به مدت ۹۰ دقیقه اولتراسانتریفیوژ گردید.رسوب حاصل که حاوی عشاءهای خام می باشد ،در بافر تریس هیدروکلراید ۵۰mM (PH 7/5) همراه با PMSF ،۲mM حل شد و استخراج دترجنتی غشای پلاسمایی به وسیله استفاده ازN- سدیم لوریل سارکوزینات انجام گرفت>.محلول نهایی که حاوی پروتئین های غشای خارجی است در مقابل تریس بافر در دمای ۴ درجه به مدت ۷۲ ساعت دیالیز گردید.به منظور جداسازی پپتیدوگلیکان از پروتئین های غشای خارجی، لیزوزیم(۱mg به ازای هر ۵۰mg پروتئین غشای خارجی) اضافه شد وبعد از این مرحله دوباره نمونه در ۱۲۰۰۰۰rpm برای ۲۰ دقیقه در دمای ۴درجه اولتراسانتریفیوژگردید.مایع رویی حاوی Omp در دمای ۴ درجه نگهداری میشود.(۱۵)
۳-۶-۲٫ اندازه‌گیری پروتئین با روش لوری:
میزان پروتئین موجود در پلی ساکارید تخلیص شده با روش لوری (۱۹۵۱)، اندازه‌گیری شد.
اصول آزمون لوری : این روش شامل دو واکنش می‌باشد، در اولین واکنش ترکیب یون مس با مولکول‌های پروتئینی بوده که در نتیجه یک کمپلکس پروتئین مس دو ظرفیتی را به وجود می‌آورد. در واکنش دوم اسید فسفوتنگستیک و اسید فسفومولیبدیک از محلول فولین باعث ایجاد رنگ خاص در کمپلکس فوق می‌شود و در کمپلکس پروتئین با مس ۲ ظرفیتی اسیدهای آمینه تیروزین و تریپتوفان احیا می‌شوند و رنگ آبی که غلظت آن بستگی به میزان پروتئین دارد ایجاد می‌شود، روش لوری بسیار دقیق بوده و حساسیت آن بین ۱ تا ۳۰۰ میکروگرم پروتئین در میلی لیتر است.(۳)
تهیه‌ی محلول‌های مورد نیاز :
محلول A: 20 گرم کربنات سدیم (Na2Cos) و ۵ گرم تارتارات مضاعف سدیم- پتاسیم را با بهره گرفتن از سود (NaoH) 1/0 مولار به حجم ۱ لیتر می‌رسانیم.
محلول B: 5 گرم سولفات مس با ۵ مولکول آب (cuso4 , 5H2o) را با بهره گرفتن از آب مقطر به حجم یک لیتر می‌رسانیم.
محلول C: 50 میلی لیتر از محلول A به اضافه ۱ میلی لیتر محلول B مخلوط نموده، (محلول C باید هنگام مصرف تهیه شود، و مدت زمان نگهداری تا خداکثر ۴ ساعت برای مصرف می‌باشد.)
محلول D: محلول فولین که در یخچال و در ظرف تیره رنگ نگه‌داری می‌شودع و به نسبت مساوی با آب مقطر رقیق می‌شود.
روش : برای تهیه‌ی استاندارد، با بهره گرفتن از مقادیر ۱۰ تا ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر سرم آلبومین گاوی (BSA) رقت‌های ۱۰، ۲۰، ۴۰،۶۰،۸۰،۱۰۰ میکرولیتر در میلی لیتر را به صورت دو پلیتیک تهیه و به هر رقت به ترتیب مقادیر ۰، ۲/۰، ۴/۶،۰/۰، ۸/۰، ۹/۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده تا حجم نهایی در هر لوله به یک میلی لیتر برسد.
سپس به هر لوله ۵ میلی لیتر محلول C اضافه نموده و ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد، سپس به هر لوله یک میلی لیتر محلول D اضافه و ۳۰ دقیقه در دمای اتاق نگه داشته شد، پس از ۳۰ دقیقه، OD نمونه‌ها را در ۵۴۰ نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس منحنی استاندارد توسط نرم افزار Excell بر اساس داده‌های فوق رسم شد.
برای اندازه‌گیری میزان پروتئین PRP تخلیص شده، حدود ۱ میلی لیتر از محلول PRP را برداشته و تمام مراحل فوق را بر روی آن انجام می‌دهیم، و میزان پروتئین آن بر اساس منحنی استاندارد محاسبه شد.
۳-۷٫ کونژوگاسیون Omp و LPS بروسلا آبورتوس
مواد و محلول مورد نیاز: سرم فیزیولوژی،ADH، EDAC، Omp؛ LPS، کیسه دیالیز،کلرید سدیم ۰/۲ نرمال
روش کار: به ۱۰ میلی گرم Omp استخراج شده به روش سدیم لوریل سارکوزینات،۲ میلی لیتر سرم فیزیولوژی افزوده و به میلی لیتر محلول معادل ۳۵ میلی گرم ADH اضافه میکنیم و ۸ میلی گرم EDAC اضافه نموده و PH نهایی محلول در را ۶/۵ تنظیم می کنیم. محلول فوق را به مدت یک ساعت در دمای اتاق گذاشته و سپس علیه ۳ تعویض آب مقطر در دمای ۴ درجه به مدت ۲۴ ساعت دیالیز نمودیم.
در مرحله بعد به ۵ میلی گرم LPS لیوفیلیزه ،۱ میلی گرم سرم فیزیولوژی افزوده و سپس به آن ۱۲ میلی گرم EDAC اضافه کرده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق می گذاریم و بعد از آن محلول فوق را قطره قطره به محلول LPS+EDAC می افزاییم.ظرف محتوی محلول را به ارامی تکان می دهیم و در آخر PH را بر روی ۶/۵ تنظیم می نماییم و محلول حاصل شده را به مدت ۳ ساعت در دمای اتاق گذاشته و سپس علیه ۳ تعویض کلرید سدیم ۰/۲ نرمال در دمای ۴ درجه به مدت ۲۴ دالیز نمودیم.
شکل(۳-۴) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS
۳-۸٫ ستون کروماتوگرافی برای تخلیص کونژوگه :