تخمیر اتانول پروسه­ی بیولوژیکی پیچیده­ای برای تولید اتانول از قند است. مخمرها تحت شرایط بی هوازی، قند را به اتانول تبدیل می­ کنند (شکل ۱-۱۴ و شکل ۱-۱۵).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

C₆H₁₂O₆ ————> C₂H₅OH + ۲CO₂ -۲۶۵kcal /kg cal
شکل ۱- ۱۴ تولید اتانول در مخمر
شکل ۱- ۱۵ تولید اتانول
فصل دوم
پیشینه­ی تحقیق
۲-۱ مخمرها در خدمت بشریت
همانگونه که اشاره شد مخمرها اهمیت و نقش بسیار زیادی در صنایع غذایی و دارویی ایفاء می­ کنند. Saccharomyces cerevisiae ارزش تغذیه­ای بالایی دارد و در ایام جنگ جهانی دوم که سربازان در نقاط دوردست از مرکز حضور داشتند و ارسال گوشت و سبزیجات به آنجا مقدور نبود، به شکل پروتئین میکروبی^[۵۲] در جیره غذایی به کار می­رفت. مخمرها هر روز برای تهیه مواد غذایی در منزل میلیون­ها خانواده در سراسر جهان مورد استفاده هستند (Hesseltine , 1974). در حال حاضر مخمرها بیشتر در تغذیه جانوران به کار می­روند تا غذای انسان، برای مثال گونه Kluyveromyc marxianus جهت تخمیر ضایعات آب پنیر حاصل از ساخت پنیر به کار می­رود و به تولید پروتئین تک سلولی(SCP) برای تغذیه جانوران و همچنین برخی الکل­ها، ضمن تقلیل آلودگی که به وسیله آب پنیر تولید می­ شود می­انجامد. از طرفی کاربرد پروتئین تک سلولی(SCP) حاصل از مخمرها به عنوان چاشنی و افزودنی­های قابل دسترسی آرد ماهی در حال حاضر استفاده می­ شود (Harrison , 1993).
در حوزه­ پزشکی پیشرفت­های قابل ملاحظه­ای در تولید پروتئین­های درمانی انسانی به وسیله­ مخمرهای مهندسی شده ژنتیکی صورت گرفته است. مثلاً در سال­های ۱۹۸۰ تا ۱۹۹۹ اولین محصول دارویی تجاری (واکسن هپاتیت B) از مخمر نوترکیب تولید و به بازار عرضه شد.
ضمناً استفاده از مخمرها در پزشکی درمانی فقط به دانش فنی DNA­ی نوترکیب مربوط نمی­ شود. برای مثال، از زمان­های اولیه مخمرها برای کنترل بیولوژیکی عفونت­های باکتریایی انسان استفاده می­شده ­اند. پیشرفت­های هیجان انگیز دیگر به آنالیز عملکردی ژنوم مخمر بر می­گردد و چنین آنالیزی ممکن است بینش وسیعی در شناخت ساختمان و عملکرد ژنوم انسانی فراهم کند (واکر، ۱۳۹۱).
اگرچه در حال حاضر بیواتانول قابل رقابت با نفت خام نیست، ولی در آینده احتمالاً بیوتکنولوژی بر روی مخمرها باعث می­ شود که بیواتانول مشتق شده از مواد سلولزی به یک محصول قابل رقابت با نفت خام تبدیل شود. مخمر می ­تواند سوخت اتانولی را از مواد خام تخمیری کربوهیدراتی تجدید پذیر تولید کند (واکر، ۱۳۹۱؛ Horecker , 1978). بر اساس تحقیقات به عمل آمده جزء موفق­ترین مخمرهایی است که در تبدیل سلولز به بیواتانول مورد مطالعه قرار گرفته است (Olsson&Hahn – Hägerad , 1996).
۲-۱-۱ مخمر در آبزی پروری
با توجه به اسناد، استفاده از مخمرها، سالها است که در آبزی پروری مورد توجه قرار گرفته است و یکی از غذاهای پذیرفته شده برای پرورش آزمایشگاهی آرتمیا استفاده از مخمرهای تک­سلولی می­باشد. محصولات مخمری همچنین به عنوان یک منبع پروتئینی در رژیم غذایی برای تولید میگو آب شور استفاده می­شوند به طورمثال استفاده از مخمرنان در آبزی پروری در چندین پروژه تحقیقاتی نتایج درخشانی را داشته است (Talloen , 1978 ; James&Makkeya, 1981). محصولات مخمری همچنین به عنوان یک منبع پروتئینی در رژیم غذایی استفاده می­شوند به طور مثال استفاده از مخمرنان در چندین پروژه تحقیقاتی برای تولید میگو آب شور نتایج درخشانی را داشته است (Talloen , 1978; James&Makkeya, 1981) .همچنین استفاده از نوعی مخمر (شبیه کاندیدا) با نام علمی Kluyveromyces sp. در تغذیه انواع مختلفی از موجودات آبزی استفاده شده است (Lavens et al, 1987; Lavens&Sorgeloos, 1991)، ضمن اینکه مخمر بعنوان یک غذای مناسب برای پرورش آبزیان توصیه شده است (Robin et al, 1987).
آزمایشاتی که توسط Blanco در سال ۱۹۸۷ بر روی تغذیه از ۵۱ گونه آبزی انجام گرفت نشان داد که مخمر Torula می ­تواند غذای مناسبی برای پرورش آرتمیا باشد. همچنین تحقیقات نشان داد که مخمر نانوایی بدون هیچ مکملی اثر تغذیه­ای کمی بر روی رشد روتیفر داشته است و اضا­فه کردن ویتامین B₁₂ و روغن به محیط کشت مخمر باعث افزایش رشد در روتیفر شده است (Hirayama&Funamot, 1983). تحقیقات نشان داده­اند که اضافه کردن مخمر به غذای ماهی باعث بالا بردن عکس­العمل­های تدافعی، ایمنی و رشد می­ شود (Siwicki et al, 1994).
پیگمان­­های استاگزانتین^[۵۳] یک نوع پیگمان قرمز رنگ کاروتنی است که رنگ کننده­ اصلی غذای سخت پوستان، ماهی­های آزاد و فلامینگوها است. تعدادی از سلول­های مخمر تولید کننده این پیگمان؛ مانند Phaffia rhodozyma در جایی که راهی برای سنتز کردن این ترکیبات قرمز نیست، برای رنگ کردن غذای ماهی­های آزاد پرورشی و میگوهای پرورشی استفاده می­ شود. سویه­های Pirodozyma با توانایی تولید بالای پیگمان، بر روی مواد خام ارزان مانند ملاس تکثیر می­شوند؛ این روش تولید جایگزین اقتصادی مناسب به جای سنتز شیمیایی استاگزانتین است (واکر، ۱۳۹۱).
۲-۲ محیط های کشت
تحقیقات متمادی انجام شده برای یافتن محیط کشت مناسب و ارزان قیمت برای افزایش رشد بهینه­ مخمرها نشان داده که ملاس چغندر یا نیشکر می ­تواند به عنوان بهترین محیط غذایی کارخانجات تولید مخمر باشد (Hongisto&Laakso, 1978) اما به دلیل کمبود منابع نیتروژنی؛ افزودن نمک­های آمونیوم یا اوره به همراه عناصر منیزیم و فسفات و ویتامین­های مختلف می ­تواند موجب رشد سریع مخمرها شود (Oura, 1974; Woehrer&Roehr, 1981). بررسی­های به عمل آمده نشان داده است که حضور سموم مختلف و فلزات سنگین در محصولات زراعی چغندر قند یا نیشکر می­توانند روی رشد مخمر تاثیر بگذارند (Reed&Nagodawithana, 1988; Perez, 2004). این عوامل مخرب در کنار افزایش قیمت ملاس موجب کاهش استفاده از ملاس برای کشت گونه­ های مختلف مخمر شده است (Arshad et al., 2008; Kopsahelis et al. ۲۰۰۹; Xandé et al., 2010). محیط­های غذایی که جدیداً مورد بررسی قرار گرفته اند عبارتند از: مخلوط ملاس با عصاره­ی قوی ذرت (۲۰:۸۰)، ضایعات زراعی متفاوت (Vu and Kim, 2009) و یا مواد دیگری مانند آب خرما (Beiroti&Hosseini, 2007) یا منابع مازاد زراعی مانند ملاس چوب.
۲-۳ اتانول و تخمیر توسط مخمرها
با توجه به اینکه اتانول محصول عمده و نهایی مسیر گلیکولیز تحت شرایط بی هوازی در اکثر مخمرها می باشد، با این حال هنگامیکه غلظت آن در محیط کشت تخمیر به ۴ درصد حجمی برسد، رشد مخمرها متوقف می­گردد (سید صیام دوست و همکاران، ۱۳۸۹).
Guilliermond و Tannerدر سال ۱۹۲۰، همانند دیگران به تفاوت در توانایی تخمیر مخمرهای مختلف اشاره کردند، بنابراین ممکن است که این تفاوت­های مشاهده شده، به علت تفاوت در توانایی تحمل (تولرانس) الکل متفاوت در مخمرها باشد. بهمین دلیل، تعدادی از گونه­ ها و سویه­های مخمر را از این نقطه نظر مورد مطالعه قرار داده و توانایی تخمیر قند تحت شرایط مختلف غلظت الکل در محیط کشت، بررسی شد (Gray , 1941).
Ingram و Buttke در سال ۱۹۹۸ و همچنین Vun uden در سال ۱۹۸۹ گزارش کردند که اتانول بطور غیر رقابتی انتقال قندها، اسیدهای آمینه و دیگر فرآیندهای مرتبط با لپیدهای غشاء را مهار، نفوذپذیری غشاء را افزایش و بدین ترتیب استحکام غشاء را کاهش می­دهد و در نهایت عملکرد سلول­ها مختل می­ شود. از این رو اصلی ترین عامل محدودکننده­ی بازده تولید اتانول، اثر بازدارندگی خود اتانول است که از نظر اقتصادی از اهمیت زیادی یرخوردار است (Ingram&Buttke, 1984؛ Van unden , 1984).
Rahm & Reed در سال ۱۹۹۵ عنوان کردند که تولید غلظت­های بالای اتانول بدلیل مهار شدن میکروارگانیسم­ها با غلظت­های بالای قند محدود می­ شود و علت آن را ایجاد فشار اسمزی بالا و متعاقب آن خروج آب از درون سلول های مخمر بیان کردند (Soudi , 1999).
Vun uden با بررسی اثر مهاری سوبسترا بر توانایی تخمیر مخمرها نشان داد که این پدیده عمدتاً بین غلظت­های ۱۵ تا ۲۵ درصد از قند رخ می­دهد. از این رو می­توان اظهار کرد که بین افزایش مقاومت به قند و اتانول در سویه­های مخمرهای بکار گرفته شده در فرایند تخمیر و افزایش تولید اتانول ارتباط مستقیمی وجود دارد (Van unden , 1984).
در یک بررسی توسط Osho در سال ۲۰۰۵، هفده مخمر از محصول تخمیری جداسازی و در سنجش مقاومت آنها ۴ سویه ی مخمر با حداکثر مقاومت به ۹ درصد به اتانول و ۲۵ درصد به قند انتخاب و شناسایی شدند که ۳ سویه به گونه ی ساکارومایسس سرویزیه و ۱ سویه به S.uvarum تعلق داشتند ( Osho&Afr , 2005).
Nwachukwa و همکارانش در سال ۲۰۰۶ نیز با روش مشابهی از محصول تخمیر یافته از خرما، ۱۳ سویه­ی مخمر مقاوم به اتانول با محدوده­ مقاومتی بین ۱۰ تا ۲۰ درصد گزارش کردند که ۹ سویه به گونه­ ساکارومایسس رویزیه و ۲ سویه به S.globosus و ۱ سویه به Hanseniaspora avarum تعلق داشتند (Nwachukwa et all,2006).
در هر دو بررسی مذکور، سویه­های منتخب بعنوان سویه­های مقاوم به اتانول و قند و مناسب جهت کاربرد صنعتی معرفی شدند. در تطابق با این مطالعه، Odunfa و Ekunsanmi در سال ۱۹۹۰ اظهار داشتند که در انتخاب یک مخمر برای بکارگیری در صنعت، بویژه در تولید اتانول، مقاومت به قند و اتانول یک برتری فیزیولوژیکی محسوب می­ شود (Campbell et all, 1998).
فصل سوم
روش شناسی
۳-۱ مقدمه:
ابتدا سویه­های مخمرهای پروبیوتیک شناسایی خواهد شد. پس از کشت ابتدایی مخمرها بر روی محیط کشت اختصاصی جامد مخمرها، به کشت آنها در محیط کشت مایع اقدام خواهد شد. مخمرهای رشد یافته در این محیط، برای کشت در مقیاس بیشتر، به داخل ارلن­های یک لیتری منتقل و کشت داده می­شوند. در نهایت مخمر حاصله پس از سانتریفیوژ، با سرم فیزیولوژی استریل، شستشو داده شده و تا زمان غذا دهی در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد (پورقدیمی، ۱۳۹۰). پس از تهیه استوک اولیه مخمرها در سویه­های مختلف، تمامی سویه­های فوق با بهره گرفتن از محیط­های کشت مختلف (YPD، YPAD، YPAC، YPG و DM) در حداقل ۳ تکرار در اپتیمم شرایط پرورشی کشت داده خواهند شد (Hahn-Hagerdal et al, 2005) و در انتهای هر دوره­ پرورشی میزان تراکم مخمر با تکنیک شمارش بر روی لام هموسیتومتر با نمونه­های شاهد و با یکدیگر مقایسه و بررسی خواهند شد. همچنین جهت بررسی توان تولید الکل، میزان تولید اتانول در هر تیمار به روش GC/FID بررسی شده و با نمونه­های شاهد و با یکدیگر مقایسه می­شوند (Corseuil et al, 1998؛ Alvarez , 1999).
۳-۱-۱ جامعه­ آماری:
نتایج کمی و کیفی سویه­های مخمرها، به عنوان جامعه آماری مورد انتظار در این تحقیق می­باشد. در هر دوره آزمایش تعداد مخمرهای تولید شده، با برداشت یک میلی لیتر از هر نمونه کشت با رقیق سازی در درون بالن ژوژه مورد شمارش قرار خواهد گرفت و جهت بررسی میزان تولید الکل اتانول نیز به همان میزان، نمونه از هر تیمار محیط کشت برداشت شده و با بهره گرفتن از تکنیک گاز کروماتوگرافی اشاره شده، بررسی خواهد شد.
۳-۲ مواد و دستگاه های مورد نیاز‌
۳-۲-۱ دستگاه ها
سانتریفیوژ (Eppendorf 5417R)، هموسیتومتر، انواع پیپت، مایکروویو، لام، اتوکلاو (ایران تولید، ایران) انکوباتورثابت (فن­آزما،-ایران)، انکوباتورشیکر (Biotek,­South­Korea)، میکروسکوپ­نوری (Zeiss, Germany)، دستگاه PH­ متر (HANA,USA)، ترازوی ­دیجیتالی (۳۰۰i, EKAND)، هود لامینار )بعثت، ایران(، سانتریفیوژ (Sigma Laboratury Centrifuge, Germany).
۳-۲-۲ مواد
سویه­های مخمری، ارلن مایر شیشه ­ای ۲ لیتری و ۱ لیتری، اسید استیک، دکستروز (گلوکز)، آب مقطر، سرم فیزیولوژی، محیط کشتSDA ، پپتون، استات سدیم، گلیسرول، لوله­ی آزمایش، انواع سمپلر وسرسمپلرها، آب دیونیزه، محلولهای رنگ آمیزی گرم (کریستال ­ویوله، لوگل، الکل استن و سافرانین)، Ca(NO3)₂.4H₂O، KH₂PO₄، MgSO₄.7H₂O، NaHCO₃، EDTAFeNa، EDTANa₂، H₃BO₃، MnCl₂.4H2O، Cyanocobalamin، Thiamine HCl، (NH₄)₆Mo₇O₂4.4H₂O، Biotin، الکل ۷۰%، پنبه، محیط کشت Mycosel Agar، محیط کشت CHA (کروم آگار کاندیدا)، محیط کشت CMA (corn meal agar)، فالکون تیوپ های ۵۰ میلی­لیتری استریل (BioPhil ٫Germany)، آدنین همی سولفات۰٫۰۰۴%، فیلترسر سرنگی ۰٫۲، K₂HPO₄، عصاره­ی مخمر (YEAST EXTRACT)، لامل سنگی، لام نئوبار، پیپت­های شیشه ­ای استریل، یخدان، یخ، ماهی قزل­آلا، آنس یا فیلدوپلاتین (لوپ و نیدل)، استوانه­ی مدرج، بشر شیشه ای، سه پایه، تور سیمی نسوز، vortex، لاکتوفنول کاتن بلو، KOH ، پارافیلم، چسب اتوکلاو، محفظه ی مرطوب، اسپاتول، پوآر.
۳-۳ جمع آوری و کشت نمونه­ها
نمونه برداری از ایستگاههای نمونه برداری در خرداد سال ۱۳۹۲ انجام شد. بدین منظور تعداد ۱۵ نمونه از ماهیان قزل­آلای رنگین­کمان از ۶ ایستگاه (مزرعه) پرورش ماهی استان اخذ شد. ماهیان بلافاصله در داخل یخ به آزمایشگاه منتقل شدند (شکل ۳-۱ و جدول ۳-۱).
شکل ۳- ۱ جمع آوری ماهی قزل آلا از ایستگاه های پرورش ماهی
جدول ۳-۱ آدرس و نام کارگاه های اخذ ماهی

کد ماهی

آدرس ایستگاه

نام کارگاه پرورش ماهی